本发明专利技术提供一种抑制肿瘤细胞增殖和迁移的Zyxin基因shRNA及重组载体与应用,具体涉及特异性沉默Zyxin(ZYX)基因的shRNA。本发明专利技术中构建的是Zyxin基因的沉默载体。首先是根据人源的Zyxin基因序列设计出shRNA片段，所合成片段两端带有合适的酶切位点，将目的片段连接到慢病毒载体上，形成核心的沉默载体。本发明专利技术构建的shRNA载体能够显著抑制Zyxin基因在蛋白水平的表达。进一步，本发明专利技术使用慢病毒作为携带shRNA载体，该载体能够靶向地将针对Zyxin基因的shRNA序列导入结直肠肿瘤细胞，显著抑制结直肠肿瘤细胞的增殖和迁移能力。
【技术实现步骤摘要】
一种抑制肿瘤细胞增殖和迁移的Zyxin基因shRNA及重组载体与应用
本专利技术属于基因工程
，涉及一种可以抑制Zyxin基因的表达，进而抑制肿瘤细胞增殖和迁移的shRNA，具体涉及一种抑制肿瘤细胞增殖和迁移的Zyxin基因shRNA及其重组载体，以及在制备抗肿瘤药物中的应用。
技术介绍
Zyxin(ZYX)基因属于LIM蛋白家族，主要分布于局部粘附(FA)并能够在细胞质或细胞核间穿梭。Zyxin的C末端有三个串联的LIM结构域，这三个结构域和很多特殊的蛋白存在相互作用，并与局部粘附有关(Schmeichel,K.L.,&Beckerle,M.C.(1994).TheLIMdomainisamodularprotein-bindinginterface.Cell,79(2),211-219)；而N末端富含脯氨酸，介导肌动蛋白极化作用。Zyxin参与肌动蛋白骨架动力学，细胞移动和信号传导在局部粘附区域,肌动蛋白极化过程中，actin调节蛋白如Arp2/3复合体，Ena/VASP蛋白都起到很重要的作用(Beckerle,M.C.(1998).Spatialcontrolofactinfilamentassembly:lessonsfromListeria.Cell,95(6),741-748.).Zyxin是局部黏附(FA)区域机械力传导系统重要的组成部分。机械信号通过zyxin聚集以及Ena/VASP招募传导肌动蛋白极化信号。有研究表明，Zyxin的N末端与α-actinin存在相互作用，该末端的缺失导致Zyxin在FA聚集减少和异位。在TGF-beta1作用下，Zyxin调节细胞骨架重组促进细胞迁移，进而诱导细胞发生上皮间质转化(EMT)，在EMT过程中，Zyxin能够通过调节细胞间连接区域的肌动蛋白膜，使得细胞在EMT过程中能够调节细胞移动，从组织中完全分离和迁移(Sperry,R.B.,Bishop,N.H.,Bramwell,J.Jetal(2010).Zyxincontrolsmigrationinepithelial-mesenchymaltransitionbymediatingactin-membranelinkagesatcell-celljunctions.JCellPhysiol,222(3),612-624.)。所以特异性的沉默Zyxin能够对某些癌细胞增殖和迁移过程中的功能研究和机制分析起到至关重要。核糖核酸干扰(RNAinterference,RNAi)作为一种基因沉默技术，已被证明可高效和特异地阻断体内特定基因的表达，从而导致细胞特异基因的沉默，使细胞表现某种基因表型的缺失。目前该技术在肿瘤的基因治疗及新药的研发等方面已经显示出广阔前景。主要策略是在体外构建能够表达RNAi的载体，然后迁移到细胞内转录RNAi的策略。常用的载体有逆转录病毒、腺病毒和慢病毒。慢病毒表达系统相比于其他表达系统，具有免疫原性低、感染效率高、感染时间长、感染效果稳定、且能感染分裂相细胞和非分裂相细胞等优点。在国外慢病毒载体技术已广泛应用到临床研究阶段，是生物医药研究领域在临床肿瘤的应用技术研究的主要手段。结直肠癌平均五年生存率为67％，但约半数以上结直肠癌患者在原发灶确诊时或行根治性切除术后发生转移,一旦发生远处转移，五年生存率仅为13％。虽然，新型分子靶向药物的应用以及治疗方案的不断改进，但转移仍然是影响结直肠癌患者治疗效果和预后的关键因素，是结直肠癌患者最主要的死因。目前尚无对Zyxin基因在肠癌细胞中增殖和迁移中的作用的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种抑制肿瘤细胞增殖和迁移的Zyxin基因shRNA，为此本专利技术提供如下沉默人源Zyxin基因表达的shRNA：Zyxin-shRNA1以SEQIDNO:1序列作为特异性沉默人源Zyxin基因表达的靶点序列，并包含其互补性碱基序列SEQIDNO:2：SEQIDNO:1CTTCCACATGAAGTGTTACAASEQIDNO:2TTGTAACACTTCATGTGGAAG。靶序列及其互补碱基序列，通过序列CTCGAG环形loop成茎环区、以回文形式相连接而形成发夹结构,再加上启动GATCCG和终止序列TTTTTA，形成特异性沉默人源Zyxin基因表达的Zyxin-shRNA1核苷酸shRNA序列(SEQIDNO:3)：SEQIDNO:3GATCCGCTTCCACATGAAGTGTTACAACTCGAGTTGTAACACTTCATGTGGAAGTTTTTA本专利技术的另一个目的是提供一种含shRNA序列的重组表达载体，所述的重组表达载体是如SEQIDNO:3所述的shRNA与慢病毒载体构建而成。所述的慢病毒载体为PLent-U6-GFP-Puro。进一步的，所述能够特异性沉默Zyxin基因表达的shRNA经由慢病毒载体表达。具体而言，这个过程包括：将编码Zyxin基因小分子干扰RNA的上述Zyxin-shRNA1核苷酸shRNA序列克隆入慢病毒载体，构建Zyxin基因干扰重组慢病毒载体，大量制备重组质粒，纯化提取载体质粒。进而，该Zyxin基因干扰重组慢病毒载体经过病毒共转染包装成为有感染力的病毒颗粒后，经纯化和浓缩收集，完成Zyxin基因shRNA慢病毒包装。上述Zyxin基因shRNA慢病毒感染人结直肠癌细胞，并最终表达所述shRNA，并特异性的抑制肿瘤细胞中的Zyxin基因的表达。本专利技术的第三个目的是提供所述Zyxin基因shRNA在制备抗肿瘤药物或试剂中的应用，尤其在制备抗结直肠肿瘤细胞药物或试剂中的应用。本专利技术提供的慢病毒重组载体能够高效侵染结直肠肿瘤细胞并抑制结直肠肿瘤细胞的Zyxin基因，显著降低Zyxin基因的蛋白水平的表达，进而显著的抑制结直肠肿瘤细胞的生长、增殖和迁移能力，促进结直肠肿瘤细胞的凋亡。增殖和迁移是恶性肿瘤最普遍的生物学特征，也是影响患者生存和预后的关键因素。为了抑制结直肠癌的增殖和转移，本专利技术提供了一种Zyxin基因的shRNA，可用于抑制肿瘤细胞的Zyxin基因的表达，并抑制结直肠肿瘤细胞的生长。Zyxin基因shRNA载体则可用于制备所述Zyxin基因的shRNA。比起瞬时表达载体，Zyxin基因shRNA慢病毒重组载体则能够高效侵染靶细胞，并进行长时间的稳定表达特异性抑制Zyxin基因的shRNA，能够显著抑制Zyxin基因在蛋白水平的表达，进而抑制结直肠肿瘤细胞的增殖和迁移能力，进一步地可以用作治疗结直肠肿瘤的药物或制剂的基础。因此慢病毒介导的Zyxin基因沉默是恶性肿瘤潜在的临床治疗方式，为恶性肿瘤的治疗提供了一条途径，在结直肠肿瘤治疗研发中具有重要意义。附图说明图1是PLent-U6-GFP-Puro慢病毒载体图谱。图2是WesternBlot方法检测三种Zyxin-shRNA慢病毒(shRNA1、shRNA2和shRNA3)感染HCT116细胞沉默Zyxin基因从而干扰Zyxin蛋白表达的效果。从结果可以看出shRNA1能有效沉默Zyxin基因表达，并且比其他shRNA有更显著的沉默效果。图3是检测慢病毒侵染人HCT116细胞系细胞增殖能力结果(HCT116-shZYX：转染Z本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种抑制肿瘤细胞增殖和迁移的Zyxin基因shRNA，其特征在于，所述的shRNA靶点的DNA序列如SEQ ID NO:1所示，靶点序列的互补性碱基序列如SEQ ID NO:2所示。
【技术特征摘要】
1.一种抑制肿瘤细胞增殖和迁移的Zyxin基因shRNA，其特征在于，所述的shRNA靶点的DNA序列如SEQIDNO:1所示，靶点序列的互补性碱基序列如SEQIDNO:2所示。2.根据权利要求1所述的Zyxin基因shRNA，其特征在于，所述shRNA包含SEQIDNO:3所示的DNA序列。3.根据权利要求1和2所述的Zyxin基因shRNA，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：余捷凯，钟晨菡，袁瑛，房雪峰，沈虹，郑树，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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