一种牛脂肪细胞的microRNA及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种牛脂肪细胞的microRNA，该牛脂肪细胞的microRNA是bta‑miR‑33a，其序列为GUGCAUUGUAGUUGCAUUGCA，利用化学合成bta‑miR‑33a的mimic和NC。根据申请人的实验表明，bta‑miR‑33a的mimic抑制脂肪细胞的增殖分化过程。可以用于调控牛前体脂肪细胞增殖分化的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种牛脂肪细胞的microRNA及其应用
本专利技术属于分子生物学、细胞工程
，具体地涉及一种牛脂肪细胞的microRNA及其用于调控牛前体脂肪细胞增殖分化的应用。
技术介绍
牛肉具有很高的营养和经济价值，但中国牛肉品质相较于肉牛产业发达的国家还相差甚远。脂肪种类和数量是影响牛肉的品质，研究牛脂肪细胞的增殖分化分子水平的调控对肉牛改良育种提供新的思路。microRNA是一类内源性非编码RNA，片段长度为22个左右的核苷酸，主要功能通过作用于3’UTR区的对靶基因转录或转录后调控。一个miRNA可以靶向上成千上百个mRNA，并且影响很多在通路上功能互作的基因的表达。miRNAs生物功能包括调节细胞早起发育、细胞分化和组织发育、基因的表达、干细胞的自我更新，另外影响肿瘤、动物病毒性疾病发生目前miRNA的mimics和inhibitor在临床发展中具有成为治疗性新药的潜力。Bta-miR-33a定位于固醇调节元件结合蛋白(SREBPs)基因16号内含子区具有调节多种生命代谢的功能。研究发现miR-33在不同肝癌细胞系中表达不同，miR-33能够抑制SMMC-7721、Huh7细胞增殖和SMMC-7721迁移，表明其对肝癌细胞的增殖和迁移具有调控作用。miR-33另一重要功能是参与脂类代谢，miR-33通过上调靶基因SREBP1参与低密度脂蛋白受体、脂肪酸和胆固醇的合成，通过下调ABCA1基因调控细胞内胆固醇输出，还能参与脂肪酸在线粒体中的氧化。在小鼠上miR-33a可以通过靶向SIRT6来调控胆固醇的合成，而SIRT6对KIF5C有负调控，KIF5C与CK2α之间互作，阻碍了CK2α的核转运和它的酶活性，从而抑制脂肪分化过程中的有丝分裂过程，对脂肪细胞有负调控作用，表明SIRT6可以通过调控有丝分裂过程来参与脂肪细胞的分化，因此miR-33a可能通过靶向SIRT6基因能够参与脂肪细胞的增殖的过程。阉牛的脂肪沉积能力强于公牛，在秦川公牛和阉牛的miRNAs-mRNAs转录组分析发现，正常公牛的肌内脂肪的bta-miR-33a的表达量是阉牛中表达量的2.2倍，表明bta-miR-33a是潜在调控牛脂肪增殖分化的microRNA。因此研究bta-miR-33a对牛脂肪细胞增殖分化具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种牛脂肪细胞的microRNA及其采用该牛脂肪细胞的microRNA用于调控牛前体脂肪细胞增殖分化的应用。为了实现上述任务，本专利技术采取如下的技术解决方案：一种牛脂肪细胞的microRNA，所述的牛脂肪细胞的microRNA是bta-miR-33a，其序列为GUGCAUUGUAGUUGCAUUGCA，其特征在于，利用化学合成bta-miR-33a的mimic和NC。根据申请人的实验表明，该牛脂肪细胞的microRNA可以用于调控牛前体脂肪细胞增殖分化的应用。进一步地，所述的bta-miR-33a的mimic和NC用lip3000TM转入到牛前体脂肪细胞。优选的，利用对增殖标志基因mRNA、Edu染色和流式细胞检测验证bta-miR-33a的mimic和NC对牛前体脂肪细胞增殖的作用。优选的，诱导脂肪细胞分化利用油红O染色验证对牛前体脂肪分化的影响。本专利技术的牛脂肪细胞的microRNA，可以抑制牛脂肪细胞增殖分化，转染到牛的前体脂肪细胞中，在48h时细胞中bta-miR-33a表达量提高了500多倍。转染之后极显著提高细胞增殖的标志基因(P＜0.01)，另外Edu染色和流式检测细胞周期，结果抑制牛脂肪细胞的增殖。诱导分化后通过油红O染色细胞中脂滴累积和甘油三酯检测，结果表明bta-miR-33a抑制牛脂肪细胞分化。可以为今后研究牛脂肪细胞增殖分化研究和肉牛改良育种提供了分子靶点。附图说明图1是bta-miR-33a的mimic转染效率的检测结果；图2是RT-PCR检测bta-miR-33a的mimic对脂肪增殖标志基因mRNA水平的影响。其中，(a)图是CCNB1的相对表达量，(b)图是CCND2的相对表达量，(c)图是PCNA相对表达量。图3是流式细胞仪检测bta-miR-33a的mimic对脂肪细胞周期影响，以及对细胞S期影响。其中，(a)图是bta-miR-33a的mimicNC处理后流式细胞仪检测细胞周期的结果图，(b)图是bta-miR-33a的mimic处理后流式细胞仪检测细胞周期结果图，(c)图是两个处理组中细胞周期的S期的所占比例。图4是EdU染色检测bta-miR-33a的mimic对细胞增殖的影响。其中第一行是bta-miR-33a的mimicNC处理组，第二行是bta-miR-33a的mimic处理组(第一列是DAPI染色结果，第二列是EdU染色结果，第三列是前两张图片的合并)。图5是油红O检测bta-miR-33a对分化脂肪细胞脂滴影响。其中第一行是bta-miR-33a的mimicNC处理组染色结果，第二行是bta-miR-33a的mimic处理组的结果。图6是甘油三酯检测结果。下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步的详细说明。具体实施方式申请人通过在线网站查询bta-miR-33a的序列，其序列为GUGCAUUGUAGUUGCAUUGCA，由上海锐博有限公司合成该microRNA序列的mimic和NC。通过采集初生犊牛的肾周脂肪获取牛前体脂肪细胞，用6孔板培养牛前体脂肪细胞，在细胞融合度为50％左右，利用lip3000TM将bta-miR-33a的mimic、NC分别转染到前体脂肪中，处理48h后进行细胞增殖变化指标检测；诱导分化10d后利用油红O染色对分化影响进行检测。以下是专利技术人给出的具体实施例和具体操作过程，但本专利技术不限于下述的实施例。以下实施例涉及的细胞、试剂来源如下：牛前体脂肪细胞，为国家肉牛改良中心初生秦川犊牛肾周脂肪通过酶消化分离获得。引物合成在上海生工生物工程股份有限公司合成。DMEM、胎牛血清(FBS)均购自Hyclone公司。Lipo3000TM转染试剂购自Promega。microRNA定量试剂盒购于天根公司。RT-PCR定量试剂盒购于Takara公司。细胞周期检测试剂盒，购于南京建成公司。EdU染色试剂盒，购自广州锐博生物公司。油红O染料，由国家肉牛改良中心提供。实施例1：bta-miR-33a的mimic、NC的细胞转染将采集前体脂肪细胞铺到6孔培养板中，待细胞密度融合度为50％时，细胞更换成无血清的培养基(DMEM/F12)饥饿两小时，然后用lip3000TM将bta-miR-33a的mimic、NC分别转染细胞中。转染后6-8h再跟换成完全培养基(89％DMEM/F12、10％的FBS、1％青霉素和链霉素)。本实施例中，申请人根据lip3000TM操作步骤，将mimic、NC(浓度：20nM)转染6孔板培养的前体脂肪细胞中(每个处理设置3个重复)，每孔转染体系见附表1。附表1：脂肪细胞的转染体系实施例2：转染mimic对细胞中bta-miR-33a和增殖标志基因转录水平影响检测将转染bta-miR-33a的mimic、NC的脂肪细胞在48h分别提取RNA，再分别进行microRNA和mRNA的cDNA的反转录。利用AB本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种牛脂肪细胞的microRNA，所述的牛脂肪细胞的microRNA是bta‑miR‑33a，其序列为GUGCAUUGUAGUUGCAUUGCA，其特征在于，利用化学合成bta‑miR‑33a的mimic和NC。

【技术特征摘要】
1.一种牛脂肪细胞的microRNA，所述的牛脂肪细胞的microRNA是bta-miR-33a，其序列为GUGCAUUGUAGUUGCAUUGCA，其特征在于，利用化学合成bta-miR-33a的mimic和NC。2.权利要求1所述的牛脂肪细胞的microRNA用于调控牛前体脂肪细胞增殖分化的应用。3.权利要求2所述的应用，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：张文振，昝林森，杨武才，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61