基于酿酒酵母CRISPR文库的工业酿酒酵母抗逆性改造制造技术

本发明专利技术设计并构建了适用于酿酒酵母的sgRNA文库(该sgRNA文库包含针对抗逆调控库中的一种或多种基因、细胞生长及代谢调控库中的一种或多种基因和/或分子及转录水平调控库中的一种或多种基因的sgRNA)，将该sgRNA文库应用于环境条件诱导的酿酒酵母适应性进化过程中，通过将CRISPR/Cas9系统的高效定向编辑与环境条件诱导的适应性进化联合，特别是借助酿酒酵母非同源末端连接(NHEJ)修复机制进行全基因组“改写”，大大推动了酿酒酵母的整体进化，获得了具备多重抗逆性(抵抗工业物料压力、温度压力和乙醇压力)的工业酿酒酵母。

【技术实现步骤摘要】
基于酿酒酵母CRISPR文库的工业酿酒酵母抗逆性改造
本专利技术涉及酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CRISPR文库的设计与构建以及应用该文库促进微生物适应性进化的方法，属于生物化工领域。
技术介绍
目前工业生物技术产品的年产值在逐年增长，在国民经济中占有很高比重，其中，微生物发酵是工业生物技术的主要组成部分。然而，现有发酵工业中，工业微生物常受高糖、高温、产物积累等发酵微环境胁迫。例如，包括酿酒酵母在内的酵母是生物产业领域非常重要的微生物细胞工厂，具有易培养、细胞生长周期短、遗传背景清晰等优点，是理想的真核生物模式菌种。作为工业生产的优良菌种，酿酒酵母能通过糖酵解途径将葡萄糖转化为乙醇。随着基因工程技术的发展，酿酒酵母被改造成工程菌用于生产各类天然产物，使酿酒酵母的应用性更为广泛。就此而言，发酵微环境胁迫会对酵母细胞产生多种影响，如错误折叠蛋白的积累、氧化磷酸化的解偶联、质膜与细胞骨架结构的破坏以及细胞蛋白分泌途径的缺失等，这些都严重影响酵母细胞的生长及代谢。提高酿酒酵母的鲁棒性，使其在多变的培养环境、较高的发酵温度下仍保持正常的生长代谢活力，成为改进酵母发酵工艺的重中之重。目前工业上主要通过发酵工艺优化(例如培养条件的人为调控)来降低胁迫，但该方法不仅增加发酵成本，而且消耗资源。因此，从源头出发提高工业微生物自身的抗逆性可有效抵抗胁迫，可以更好地发挥其作用。对此，虽然近年来国内外通过微生物的抗逆机制进行理性设计和适应性进化能够使微生物具有一定的抗逆性，但所得成果比较局限，主要集中于细胞单一抗逆性研究(例如耐高温胁迫或耐乙醇胁迫等)，难以获得响应工业发酵微环境的多重抗逆性，并且当前研究多以实验室模式菌株为研究对象，在实际工业应用中仍然受到限制。整体来说，迄今为止，就提高微生物本身的抗逆性而言，国内外学者主要从适应性进化和基于现有抗逆机制进行理性设计这两方面开展了研究。近几年已经开发了结合原生质体融合的基因组重排技术(Genomeshuffling)、改造基因组范围转录调控程序的全局转录机制工程(Globaltranscriptionmachineryengineering，gTME)、基因组复制工程辅助的连续进化(Genomereplicationengineeringassistedcontinuousevolution，GREACE)、基因组多重位点自动改造技术(Multiplexautomatedgenomeengineering，MAGE)等育种技术来提高微生物的抗逆性。虽然目前基于环境条件诱导的传统适应性进化技术在提高微生物抗逆性方面呈现出一定效果，但如上所述，这种单一环境条件的传统适应性进化技术耗时、低效、工作量大；另一方面，基于现有抗逆机制进行理性设计，即，基于分子层面的构建方法针对性强，但不同胁迫环境响应不同的耐受机制，且不同耐受机制间又存在错综复杂的交互关系，造成针对某一耐受机制的理性设计结果往往并不显著，同时也并非所有的微生物特性都能通过理性的技术进行改造，缺乏一定的普适性。DNA作为携带遗传信息的载体，其容易发生持续性损伤，其中最严重的损伤就是DNA双链断裂(Doublestrandbreak，DSB)，双螺旋结构会一分为二。如果细胞中类似的DNA损伤不能被有效修复的话，重要的遗传信息就会出现缺失，这时候就会伴随细胞死亡的发生，或者诱发永久性的遗传改变以及细胞转化。相应地，快速准确地修复DSB对维持基因组稳定性起着至关重要的作用。真核生物细胞通过一系列复杂的信号转导途径激活对DSB的修复以恢复DNA中的遗传信息，其在精确性和复杂性上存在一定差异，其中最重要的两种方式是同源重组(homologousrecombination，HR)修复和非同源末端连接(non-homologousendjoining，NHEJ)修复。HR修复能够利用姐妹染色体中完全相同的遗传信息来以较高的准确率修复损伤的DNA；然而经修复的子代拷贝仅会在分裂的细胞中存在，在细胞分裂之前遗传信息就会被复制，并且HR修复仅发生在DNA经历或完成复制的S期和G2期。相比而言，NHEJ修复无需模板，能够尽可能快速地将两个断裂末端进行连接，并且可在整个细胞周期发生，从而成为哺乳动物细胞中修复DSB的主要方式。事实上，适应性进化的过程即为通过外界压力导致细胞内DNA发生诸如DSB等极为严重的损伤，然后依赖微生物自身普遍存在的DNA修复机制进行修复的过程。在修复过程中，特别是在只基于断裂末端的结构而无需模板的NHEJ修复过程中，可能出现插入、缺失、碱基改变等情况，进而使细胞呈现多种表型。对此，如果能够设法促进微生物细胞内DNA发生损伤并进行修复的进程，则可大大推动适应性进化的进展。成簇的规律间隔短回文重复序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPR)作为细菌和古细菌的“免疫系统”广泛存在于细菌和古细菌基因组中。CRISPR系统的免疫干扰过程主要包括三个阶段：适应、表达和干扰。在适应阶段，CRISPR系统将来自噬菌体或质粒的DNA短片段整合到前导序列和第一段重复序列之间，每一次整合都伴随着重复序列的复制，进而形成一个新的重复-间隔序列单元。该间隔序列(spacer)记录了之前入侵的外源DNA。在表达阶段，CRISPR基因座被转录成一段CRISPRRNA(crRNA)前体(称为pre-crRNA)，该前体被Cas9的核酸内切酶结构域剪切并进一步加工成小crRNA。成熟crRNA与Cas蛋白形成Cas9-tracrRNA:crRNA复合体。在干扰阶段，crRNA通过其与靶序列互补的区域引导Cas9-tracrRNA:crRNA复合体寻找靶点，并在靶点位置通过Cas蛋白的核酸酶活性造成靶点位置的双链DNA发生断裂，从而使入侵的靶标DNA失去原有功能。酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的CRISPR/Cas9系统是分子生物学和细胞生物学中最常用的CRISPR/Cas系统。Cas9蛋白在crRNA的成熟和对靶DNA的剪切中发挥重要作用。在该系统中，反式编码小RNA(trans-encodedsmallRNA，tracrRNA)扮演了导向的角色。Jinek等将tracrRNA与spacerRNA组合为sgRNA分子，将其与Cas9进行混合，发现能够正确地对目标DNA进行切割(PennisiE，TheCRISPRcraze，Science341(6148)：833-836，2013；AProgrammableDual-RNA-GuidedDNAEndonucleaseinAdaptiveBacterialImmunity，Jinek等，337(6096)：816-821)。考虑到CRISPR/Cas9系统能够特异性地对基因组进行高效编辑，倘若能够将环境条件诱导的传统适应性进化策略的优势与新一代基因组编辑技术CRIPSR/Cas9的高效性相结合，从而加速菌株的适应性进化过程，在提高其它工业微生物对发酵微环境的抗逆性及生产性能方面具有重要的参考价值，对高效低耗的生物发酵产业也具有重要的推动作用。目前，尽管本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于提高酿酒酵母抗逆性的sgRNA文库，所述sgRNA文库包含针对抗逆调控库中的一种或多种基因、细胞生长及代谢调控库中的一种或多种基因和/或分子及转录水平调控库中的一种或多种基因的sgRNA，其中，所述抗逆调控库包含热激蛋白基因、泛素系统基因、蛋白酶体基因、抗高渗调节基因、pH响应调节基因、蛋白质平衡基因、蛋白质质量控制系统基因、分子伴侣基因、抗氧化防御系统基因、超氧化物歧化酶基因、自噬系统基因；所述细胞生长及代谢调控库包含翻译后调控基因、转录调控基因、抑制调控基因、衰老调控基因、同源保守区基因、糖酵解调控基因、线粒体生物合成调控基因、URS2负调控基因、细胞周期调控基因、核糖核酸酶系统基因、细胞膜调控基因、核糖核酸聚合酶调控基因；以及所述分子及转录水平调控库包含SR蛋白激酶基因、Gal系统基因、信号转导基因、金属硫蛋白多路调控基因、亮氨酸拉链式二聚体基因、钙调系统基因、氮调节基因、组蛋白调节基因、核内RNA前体下调基因、嘧啶通路调节基因、多肽逆行调控基因、血红素生物合成途径调控基因、磷酸丙酮酸水合酶(烯醇酶)调节基因、多肽氧调节基因。

【技术特征摘要】
1.一种用于提高酿酒酵母抗逆性的sgRNA文库，所述sgRNA文库包含针对抗逆调控库中的一种或多种基因、细胞生长及代谢调控库中的一种或多种基因和/或分子及转录水平调控库中的一种或多种基因的sgRNA，其中，所述抗逆调控库包含热激蛋白基因、泛素系统基因、蛋白酶体基因、抗高渗调节基因、pH响应调节基因、蛋白质平衡基因、蛋白质质量控制系统基因、分子伴侣基因、抗氧化防御系统基因、超氧化物歧化酶基因、自噬系统基因；所述细胞生长及代谢调控库包含翻译后调控基因、转录调控基因、抑制调控基因、衰老调控基因、同源保守区基因、糖酵解调控基因、线粒体生物合成调控基因、URS2负调控基因、细胞周期调控基因、核糖核酸酶系统基因、细胞膜调控基因、核糖核酸聚合酶调控基因；以及所述分子及转录水平调控库包含SR蛋白激酶基因、Gal系统基因、信号转导基因、金属硫蛋白多路调控基因、亮氨酸拉链式二聚体基因、钙调系统基因、氮调节基因、组蛋白调节基因、核内RNA前体下调基因、嘧啶通路调节基因、多肽逆行调控基因、血红素生物合成途径调控基因、磷酸丙酮酸水合酶(烯醇酶)调节基因、多肽氧调节基因。2.如权利要求1所述的sgRNA文库，其中，针对每个基因设计6个sgRNA；优选地，针对每个基因的起始密码子上游300bp区域设计2个sgRNA，并针对每个基因的CDS区5％-65％范围设计4个sgRNA。3.如权利要求1或2所述的sgRNA文库，其中，所述sgRNA的长度为20nt。4.包含如权利要求1-3中任一项所述的sgRNA文库的试剂盒。5.如权利要求4所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含sgRNA克隆载体、Cas9核酸酶和酿酒酵母细胞；优选地，所述试剂盒进一步包含克隆载体、sgRNA体外转录试剂、Cas9核酸酶切缓冲液、酵母转化试剂或上述物质的任意组合。6.利用如权利要求1-3中任一项所述的sgRNA文库获得酿酒酵母CRISPR文库的方法，所述方法包括：(1)将所述sgRNA文库转化至过表达NHEJ通路相关基因并带有Cas9表达质粒的酿酒酵母中；(2)将转化所述sgRNA文库后的酿酒酵母接种入培养基中进行培养，得到酿酒酵母培养液；(3)过滤步骤(2)中得到的酿酒酵母培养液，获得菌浊液，当活菌率为15-20％时进行下一轮转化；(4)以步骤(3)中得到的活菌率为15-20％的菌浊液作为种子液，将其过夜活化后，筛选出上一轮转入的sgRN...

【专利技术属性】
技术研发人员：佟毅，张媛，白文鑫，王小艳，王燕，王康，李义，李凡，袁敬伟，刘辉，
申请(专利权)人：吉林中粮生化有限公司，中粮营养健康研究院有限公司，中粮生化能源肇东有限公司，中粮生物化学安徽股份有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林,22