特异靶向羊友好位点H11的sgRNA及其编码DNA和应用制造技术

本发明专利技术提供了特异靶向羊友好位点H11的sgRNA及其编码DNA和应用。本发明专利技术的sgRNA序列如SEQ ID NO.1或2所示，转录所述sgRNA序列的DNA序列如SEQ ID NO.3或4所示。本发明专利技术的sgRNA能特异识别羊的H11位点，引导Cas9核酸内切酶对该位点进行高效切割，打靶效率在70％以上，能有效减少CRISPR/Cas9系统存在的脱靶现象，进而减少非特异性切割所引起的基因组非靶向位点的Indel带来的影响。基于本发明专利技术提供的sgRNA构建Cas9/sgRNA表达系统可实现在细胞或个体水平上对羊H11位点进行靶向修饰，用于研究相关时空特异性表达基因以及培育新品种基因编辑羊。

【技术实现步骤摘要】
特异靶向羊友好位点H11的sgRNA及其编码DNA和应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体地说，涉及特异靶向羊友好位点H11的sgRNA及其编码DNA和应用。
技术介绍
Hipp11(H11)位点，简称H11位点最初由斯坦福大学的SimoHippenmeyer等人于2010年在小鼠的第11号染色体上分离鉴定出的外源基因友好位点(SafeHarbor)。之后，研究人员进一步在转基因小鼠和人的干细胞中验证。在小鼠上，H11位点位于Eif4enif1和Drgl两个基因之间，位于11号染色体着丝粒附近，是基因间区，安全性高，无基因沉默效应。研究表明在H11位点整合外源基因，小鼠的生理生化指标和繁殖能力不受影响。相比于小鼠的Rosa26整合位点，H11位点具有更高的整合效率。2015年，已有研究人员利用CRISPR/Cas9系统成功地将9kb左右的基因片段插入了猪的H11位点。在羊的外源基因插入位点当中，最常用的是Rosa26位点，该位点具有全身表达的特性，在该基因上打靶的转基因动物和野生型生长发育无区别，但是，其为假基因，虽然不编码蛋白，但有潜在参与其他基因转录调控的功能。假基因虽然是在遗传进化过程中的“DNA垃圾”，虽然其不编码蛋白，但是，最近的研究表明基因组中大量的非编码序列，如miRNA、LncRNA等在相关基因的表达调控中起了至关重要的作用。另外，Rosa26位点的启动子为全身性广谱表达，难以做到组织特异性表达，而目前基于基因功能的研究往往需要具体到某种细胞某种组织，甚至还需要特定的时间来表达目的基因，而H11位点则不存在这个难题，其位于基因的间隔区，并且不存在启动子，因此，在假基因区打靶尚存在未知的生物安全风险，相比之下，H11位点更具有外源基因定点整合的优势。可以根据科研需要，将特异性的启动子构建到该靶点从而实现目的基因的时空特异性表达，更具体的研究基因功能。如果在羊的基因组中定位H11这样安全有效的基因修饰位点，将有利于基因编辑羊新品种的培育。自最早的基因编辑技术锌指核酸酶(ZFNs)问世以来，新的基因编辑技术发展如火如荼，先后又诞生了转录激活因子类似效应因子核酸酶(TALENs)和RNA指导的CRISPR/Cas核酸酶系统。前两种技术是将DNA结合蛋白组件与核酸内切酶催化结构域连接，在特定的基因位点诱导靶向DNA双链断裂(DSB)，其构建过程均较为繁琐。CRISPR-Cas9是一种微生物适应性免疫系统，使用RNA引导的核酸酶切割DNA。相比于ZFN和TALEN，CRISPR-Cas9系统操作更简单，效率也更高。如果能筛选到高效且特异性靶向编辑H11位点的CRISPR-Cas的gRNA序列，引导Cas9核酸酶对该位点进行靶向编辑，就能为制备H11位点定点整合外源或内源目的基因的基因编辑羊提供有力的技术支撑。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种打靶效率高、脱靶率低的特异靶向羊友好位点H11的sgRNA及其应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术首先提供了特异靶向羊友好位点H11的sgRNA，其RNA序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。具体地，转录所述sgRNA的DNA序列如SEQIDNO.3(转录SEQIDNO.1)或SEQIDNO.4所示(转录SEQIDNO.2)。本专利技术所述羊友好位点H11位于羊第17染色体，其核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。含有本专利技术所述sgRNA的CRISPR/Cas9打靶载体属于本专利技术的保护范围。进一步地，本专利技术提供了一种CRISPR/Cas9打靶载体，含有药物筛选标记puro。该筛选标记能够在短时间内富集更多的阳性细胞。优选地，在转染打靶载体时利用和打靶载体大小近似的带荧光的PX458(比PX459大114bp)载体做对照，能实时准确监测转染效率。本专利技术经过大量实验筛选发现，细胞转染Cas9打靶载体时采用核转的方式其转染效率优于脂质体转染和新型DNA聚合转染试剂。因此优选采用核转染大分子量的打靶载体。本专利技术的实施例中，在检测打靶效率时采用直接TA克隆测序的方法，避免了利用T7E1和Surveyor酶切时会出现假阳性结果的可能性。本专利技术提供了所述sgRNA或含有其的CRISPR/Cas9打靶载体在特异识别和靶向修饰羊友好位点H11中的应用。进一步地，所述靶向修饰为基因敲除、基因转入或定点过表达内源基因。本专利技术提供了所述sgRNA或含有其的CRISPR/Cas9打靶载体在在制备转基因动物或动物种质资源改良中的应用。本专利技术提供了所述sgRNA或含有其的CRISPR/Cas9打靶载体在培育新品种基因编辑羊的应用。本专利技术提供了所述sgRNA或含有其的CRISPR/Cas9打靶载体在利用相关时空特异性表达基因中的应用。在羊的基因编辑中，基因敲除的研究要远远多于基因敲入，不同于基因敲除，基因敲入涉及到基因组中的插入位置，要求插入的基因座既能高效表达而又不能对原来染色体上的基因功能造成干扰，因此插入位置的选择就显得尤为重要，羊的H11位点还未被开发，本申请筛选到了高效且特异性靶向编辑H11位点的CRISPR-Cas的gRNA序列，引导Cas9核酸内切酶对该位点进行高效切割，打靶效率在70％以上，能有效减少CRISPR/Cas9系统存在的脱靶现象，进而减少非特异性切割所引起的基因组非靶向位点的Indel带来的影响，这为外源基因的插入提供新的安全的选择。另外，利用传统方法对动物内源性基因进行过表达时往往会造成目的基因的随机整合，后代的疑似阳性的表型可能并非是目的基因本身发挥的作用，很大程度上是其随机插入导致了其他功能基因的变异，因此，过表达目的基因的插入位点也十分关键，本申请提供的特异靶向羊H11友好位点的sgRNA结合CRISPR-Cas9技术既能用来插入外源基因，也能用来定点过表达内源性基因，这为家畜重要经济性状相关基因功能的研究奠定了基础。附图说明图1不同物种H11位点染色体定位示意图。图2羊H11位点打靶示意图。图3打靶载体酶切电泳图。图4sgRNA连接打靶载体质粒PCR电泳图。图5H11-sgRNA1测序比对结果。深色标识部分为sgRNA序列信息，其对应测序峰图部分加深显示。图6H11-sgRNA2测序比对结果，深色标识部分为sgRNA序列信息，其对应测序峰图部分加深显示。图7Lipofectamine2000转染效果，A、B、C代表三次转染情况，A1、B1、C1为荧光图片，A2、B2、C2为明场图片。图8HD转染效果。A、B、C代表三次转染情况，A1、B1、C1为荧光图片，A2、B2、C2为明场图片。图9转染效果，A、B、C代表三次转染情况，A1、B1、C1为荧光图片，A2、B2、C2为明场图片。图10核转染效果，A、B、C、D代表四次转染情况，A1、B1、C1、D1为荧光图片，A2、B2、C2、D2为明场图片。图11药物筛选过程，Day1代表加药筛选后第1天，Day3代表加药筛选后第3天，其他标识含义以此类推。图12靶点附近序列的PCR扩增电泳图。图13PCR产物测序结果图。图14sgRNA1靶位点的TA克隆测序结果。图14A，图14B，图14C，图14D，图14E分别代表sgRNA1靶点五种不同的Indel类型，图14F为未发生突变的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.特异靶向羊友好位点H11的sgRNA，其RNA序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.特异靶向羊友好位点H11的sgRNA，其RNA序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。2.如权利要求1所述的sgRNA，其特征在于，转录所述sgRNA的DNA序列如SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示。3.如权利要求1或2所述的sgRNA，其特征在于，所述羊友好位点H11位于羊第17染色体，其核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。4.含有权利要求1-3任一所述sgRNA的CRISPR/Cas9打靶载体。5.如权利要求4所述的CRISPR/Cas9打靶载体，其特征在于，含有药物筛选标记puro。6.权利要求1-3任一所述的sgRNA或权利要求4-5任...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘国世，李广栋，张鲁，连正兴，吴英杰，吕东颖，姚昱君，朱天奇，姬鹏云，杨明辉，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11