一种提取多糖多酚植物总RNA的方法技术

技术编号:20884356 阅读:62 留言:0更新日期:2019-04-17 13:29
本发明专利技术公开了一种提取多糖多酚植物总RNA的方法,用针对多糖多酚植物的裂解液和β‑巯基乙醇溶液代替Trizol溶液对植物组织进行裂解,并加入水饱和酚减少DNA的混入,同时加入β‑巯基乙醇降低氧对细胞产生的氧化损伤。本发明专利技术与CTAB法相比免去了溶液的配制和灭菌过程,大大缩减了时间,并能有效避免植物中糖类和酚类对总RNA的降解,同时能够完全清除RNA中混有的蛋白质和DNA。本方法所提取的总RNA可以满足对Micro RNA以及其靶基因的研究。

【技术实现步骤摘要】
一种提取多糖多酚植物总RNA的方法
本专利技术涉及生物学领域,具体涉及一种提取多糖多酚植物总RNA的方法。
技术介绍
RNA是基因表达过程中非常重要的生物分子,对其分离纯化是研究基因功能的重要基础之一。高质量的RNA对于后续文库构建、RNA-seq以及其他的分子生物学分析极其重要。而对于大多数植物组织来说,抽提高质量的RNA显得尤为重要,因为绝大多数植物材料富含多糖、多酚、蛋白质以及次级代谢产物。多酚类物质在研磨过程中很容易被氧化,并能结合蛋白质和核酸形成大分子物质;在提取过程中,多糖和多酚类物质可能会导致RNA降解,干扰后续的实验应用,而普通的Trizol法提取植物总RNA的方法不能去除植物中的糖类和酚类。
技术实现思路
为解决上述问题,本专利技术提供了一种提取多糖多酚植物总RNA的方法,用针对多糖多酚植物的裂解液代替Trizol溶液对植物组织进行裂解,并加入水饱和酚减少DNA的混入,同时加入β-巯基乙醇降低氧对细胞产生的氧化损伤。为实现上述目的,本专利技术采取的技术方案为:一种提取多糖多酚植物总RNA的方法,包括如下步骤:S1、取适量组织样品用液氮充分研磨3~5次后,取200mg磨碎的组织样品置于2mLEP管中,加入1mL多糖多酚植物专用裂解液和50µL的β-巯基乙醇,立即漩涡震荡混匀,室温静置15min,使其充分裂解后,4℃,12000r/min离心10min;S2、吸取上清液转移至新的2mLEP管中,冰上操作,加入等体积氯仿和水饱和酚的混合液(氯仿:水饱和酚=1:1),轻微震荡混匀,室温静置分层5min后,4℃,12000r/min离心10min;S3、吸取上清液转移至新的2mLEP管中,冰上操作,加入200µL氯仿,轻微震荡混匀,室温静置分层,然后4℃,12000r/min离心10min。S4、吸取上清液转移至新的1.5mLEP管中,冰上操作,加入等体积的预冷至-20℃的无水乙醇,-80℃,静置30min,让RNA充分析出后,4℃,12000r/min离心10min;S5、弃上清,加入1mL75%的乙醇,温和震荡洗涤5min后,4℃,12000r/min离心5min;S6、弃上清,加入1mL无水乙醇,温和震荡洗涤5min后,4℃,12000r/min离心5min,弃上清,风干处理20-30min;S7、加入由10µLDNase和70µLRDD缓冲液混合而成的混合液,混匀,室温静置约15min;S8、加入200µLRNase-free水,混匀,再加入100µL氯仿,轻轻混匀,室温静置至分层;4℃,12000r/min离心10min;S9、吸取上清液转移至新的1.5mLEP管中,冰上操作,加入1mL预冷至-20℃的无水乙醇,-80℃,静置30min后,4℃,12000r/min离心10min;S10、弃上清,加入1mL75%乙醇,温和震荡洗涤5min后,4℃,12000r/min离心5min;S11、弃上清,加入1mL无水乙醇,温和震荡洗涤5min后,4℃,12000r/min离心5min;S12、弃上清,室温风干,加入20-50µLRNase-free水进行溶解,即得总RNA,-80℃存放。本专利技术具有以下有益效果:有效避免了植物中糖类和酚类对总RNA的降解,同时能够完全清除RNA中混有的蛋白质和DNA。本方法所提取的总RNA可以满足对MicroRNA以及其靶基因的研究。附图说明图1为用Trizol法提取的多糖多酚类植物的RNA琼脂糖胶图。图2为采用本专利技术实施例的方法所提取的总RNA琼脂糖胶图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本专利技术,但不以任何形式限制本专利技术。应当指出的是,对本领域的普通技术人员来说,在不脱离本专利技术构思的前提下,还可以做出若干变形和改进。这些都属于本专利技术的保护范围。实施例一种提取多糖多酚植物总RNA的方法,包括如下步骤:S1、取适量组织样品用液氮充分研磨3~5次后,取约200mg磨碎的组织样品置于2mLEP管中,加入1mL多糖多酚植物专用裂解液和50µLβ-巯基乙醇,立即漩涡震荡混匀,室温静置15min,使其充分裂解后,4℃,12000r/min离心10min;S2、吸取上清液(约900µL)转移至新的2mLEP管中,冰上操作,加入等体积氯仿和水饱和酚的混合液(氯仿:水饱和酚=1:1),轻微震荡混匀,室温静置分层5min后,4℃,12000r/min离心10min;S3、吸取上清液(约800µL)转移至新的2mLEP管中,冰上操作,加入200µL氯仿,轻微震荡混匀,室温静置分层,然后4℃,12000r/min离心10min。S4、吸取上清液(约700µl)转移至新的1.5mLEP管中,冰上操作,加入等体积的预冷至-20℃的无水乙醇,-80℃,静置30min~2h,让RNA充分析出后,4℃,12000r/min离心10min;S5、弃上清,加入1mL75%的乙醇,温和震荡洗涤约5min后,4℃,12000r/min离心5min;S6、弃上清,加入1mL无水乙醇,温和震荡洗涤约5min后,4℃,12000r/min离心5min,弃上清,风干处理约20-30min;S7、加入由10µLDNase和70µLRDD缓冲液混合而成的混合液,混匀,室温静置约15min,如果室温温度较低,适当增加混合液的体积,此步骤是为了去除RNA中的DNA;S8、加入200µLRNase-free水,混匀,再加入100µL氯仿,轻轻混匀,室温静置至分层;此步骤是为了去除RNA中的DNase;S9、吸取上清液转移至新的1.5mLEP管中,冰上操作,加入1mL预冷至-20℃的无水乙醇,-80℃,静置30min后,4℃,12000r/min离心10min;S10、弃上清,加入1mL75%乙醇,温和震荡洗涤约5min后,4℃,12000r/min离心5min;S11、弃上清,加入1mL无水乙醇,温和震荡洗涤约5min后,4℃,12000r/min离心5min;S12、弃上清,室温风干,加入20-50µLRNase-free水进行溶解,即得总RNA,-80℃存放。对比例1.将组织样品直接放入无RNase研体中,加入少量液氮,迅速研磨,如此反复3-5次后,取50-100mg组织转移入离心管,加入1mlTrizol溶液用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟,室温放置15min,使其充分裂解;2.12000rpm离心10min,弃沉淀,加入200ul氯仿,振荡混匀15分钟,室温放置15min,4℃,12000g离心15min;3.吸取上层水相至另一离心管中,加入0.5ml异丙醇,混匀,室温放置5-10min,4℃12000g离心10min,弃上清,RNA沉于管底;4.加入1ml75%乙醇,温和振荡离心管,悬浮沉淀,4℃8000g离心5min,尽量弃上清,室温晾干或真空干燥5-10min。注:RNA样品不要过于干燥,否则很难溶解。5.可用50ulH2O,TEbuffer或0.5%SDS溶解RNA样品,55-60℃,5-10min。注:H2O、TE或0.5%SDS均须用DEPC处理并高压。在提取的RNA中,如果18S的条带亮度弱于28S的条带,说明所提取的RNA比较完整,本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提取多糖多酚植物总RNA的方法,其特征在于:包括如下步骤:S1、取适量组织样品用液氮充分研磨3~5次后,取200mg磨碎的组织样品置于2mL EP管中,加入1mL多糖多酚植物专用裂解液和50µL的β‑巯基乙醇,立即漩涡震荡混匀,室温静置15min,使其充分裂解后,4℃,12000r/min离心10min;S2、吸取上清液转移至新的2mL EP管中,冰上操作,加入等体积氯仿和水饱和酚的混合液,轻微震荡混匀,室温静置分层5min后,4℃,12000r/min离心10min;S3、吸取上清液转移至新的2mL EP管中,冰上操作,加入200µL氯仿,轻微震荡混匀,室温静置分层,然后4℃,12000r/min离心10min。S4、吸取上清液转移至新的1.5mL EP管中,冰上操作,加入等体积的预冷至‑20℃的无水乙醇,‑80℃,静置30min,让RNA充分析出后,4℃,12000r/min离心10min;S5、弃上清,加入1mL 75%的乙醇,温和震荡洗涤5min后,4℃,12000r/min离心5min;S6、弃上清,加入1mL无水乙醇,温和震荡洗涤5min后,4℃,12000r/min离心5min,弃上清,风干处理20‑30min;S7、加入由10µLDNase和70µL RDD缓冲液混合而成的混合液,混匀,室温静置约15min;S8、加入200µL RNase‑free水,混匀,再加入100µL氯仿,轻轻混匀,室温静置至分层;4℃,12000r/min离心10min;S9、吸取上清液转移至新的1.5mL EP管中,冰上操作,加入1mL预冷至‑20℃的无水乙醇,‑80℃,静置30min后,4℃,12000r/min离心10min;S10、弃上清,加入1mL 75%乙醇,温和震荡洗涤5min后,4℃,12000r/min离心5min;S11、弃上清,加入1mL无水乙醇,温和震荡洗涤5min后,4℃,12000r/min离心5min;S12、弃上清,室温风干,加入20‑50µL RNase‑free水进行溶解,即得总RNA,‑80 ℃存放。...

【技术特征摘要】
1.一种提取多糖多酚植物总RNA的方法,其特征在于:包括如下步骤:S1、取适量组织样品用液氮充分研磨3~5次后,取200mg磨碎的组织样品置于2mLEP管中,加入1mL多糖多酚植物专用裂解液和50µL的β-巯基乙醇,立即漩涡震荡混匀,室温静置15min,使其充分裂解后,4℃,12000r/min离心10min;S2、吸取上清液转移至新的2mLEP管中,冰上操作,加入等体积氯仿和水饱和酚的混合液,轻微震荡混匀,室温静置分层5min后,4℃,12000r/min离心10min;S3、吸取上清液转移至新的2mLEP管中,冰上操作,加入200µL氯仿,轻微震荡混匀,室温静置分层,然后4℃,12000r/min离心10min。S4、吸取上清液转移至新的1.5mLEP管中,冰上操作,加入等体积的预冷至-20℃的无水乙醇,-80℃,静置30min,让RNA充分析出后,4℃,12000r/min离心10min;S5、弃上清,加入1mL75%的乙醇,温和震荡洗涤5min后,4℃,12000r/min离心5min;S6、弃上清,加入1mL...

【专利技术属性】
技术研发人员:李丹李兴河赵存鹏郭宝生刘素恩王凯辉王兆晓耿军义
申请(专利权)人:河北省农林科学院棉花研究所河北省农林科学院特种经济作物研究所
类型:发明
国别省市:河北,13

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