一种海洋生物源超氧化物歧化酶提取分离工艺制造技术

本发明专利技术公开了一种海洋生物源超氧化物歧化酶提取分离工艺，本发明专利技术的一种海洋生物源超氧化物歧化酶提取分离工艺，将内脏和鱼血分别进行粗提取后，再对离心得到的提取液进行纯化，提取制备的超氧化物歧化酶，纯度高、产量高，其单位酶活可以达到6000U/mg以上。在进行内脏粗提取和鱼血粗提取时改变了传统提取方法中大量的有机溶剂及无机盐硫铵的使用，不仅降低了因添加这些试剂引起的对超氧化物歧化酶活性及安全性的影响，而且降低了对于试剂的浪费及后续的去除工艺，均降低了其产业成本。原材料为海鱼的内脏和鱼血，有效的降低因加工鱼产品产生大量副产物所带来的环境污染及资源浪费，实现废物利用，变废为宝。

【技术实现步骤摘要】
一种海洋生物源超氧化物歧化酶提取分离工艺
本专利技术涉及超氧化物歧化酶提取制备
，具体是一种海洋生物源超氧化物歧化酶提取分离工艺。
技术介绍
超氧化物歧化酶，别名肝蛋白、简称：SOD。SOD是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。对人体不断地补充SOD具有抗衰老的特殊效果。超氧化物歧化酶是1938年首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶开始算起，人们对SOD的研究己有七十多年的历史。1969年McCord等重新发现这种蛋白，并且发现了它们的生物活性，弄清了它催化过氧阴离子发生歧化反应的性质，所以正式将其命名为超氧化物歧化酶。超氧化物歧化酶是一种新型酶制剂。它在生物界的分布极广，几乎从动物到植物，甚至从人到单细胞生物，都有它的存在。SOD被视为生命科技中最具神奇魔力的酶、人体内的垃圾清道夫。SOD是氧自由基的自然天敌，是机体内氧自由基的头号杀手，是生命健康之本。SOD是生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内，如动物，植物，微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。SOD在生物体内的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标；现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的对细胞伤害。由于现代生活压力，环境污染，各种辐射和超量运动都会造成氧自由基大量形成；因此，生物抗氧化机制中SOD的地位越来越重要！目前我国传统工业大多从动物的血液和内脏器官中提取，但这类原料来源有限，成分复杂，且在储存、运输等方面存在诸多不便，因此容易导致生产工艺复杂化，使生产成本大幅度上升。目前为止SOD产品来源方面主要还是以猪牛血、肝脏等动物组织为主，已建立了从动物血红细胞中分离纯化SOD的多种方法。在传统SOD的提取纯化过程中，分别使用了大量的有机溶剂丙酮及无机盐硫酸按，这些试剂的加入不仅影响酶的活性，而且对于试剂的浪费及后续的去除工艺，均提高了其产业成本。并且动物本身携带各种细菌病毒等，这就不可避免地容易发生一些交叉感染，过敏性反应等现象，特别是口蹄疫、疯牛病以及由动物传播的恶性传染病的蔓延，人们对于从猪、牛提取SOD等活性成分的安全性产生了质疑，生产动物源血液制品的风险加大，许多国家和地区抵制以动物血液及内脏为原料制取的超氧化物歧化酶，使得超氧化物歧化酶在国际市场上极为紧缺。因此需要提出一种以海洋生物为原材料的超氧化物歧化酶提取分离工艺。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种海洋生物源超氧化物歧化酶提取分离工艺，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种海洋生物源超氧化物歧化酶提取分离工艺，具体包括以下步骤：S1、取新鲜的海鱼，取出内脏和鱼血，将内脏清洗干净，沥干后备用，往鱼血中加入5-10％鱼血质量的柠檬酸钠，混合均匀后冷藏备用；S2、将清洗干净的内脏进行打浆，得到内脏浆液；S3、往内脏浆液中加入磷酸缓冲溶液，调节提取液pH6.5-7.5，40-60℃下搅拌提取2-6h，得到内脏提取液；S4、对内脏提取液进行加热去除杂蛋白，后离心去除沉淀，得上清液A；S5、将鱼血置于离心机中离心，沉淀物用生理盐水洗涤，制得红细胞，用超声波破壁处理，加入去离子水，冰浴下静置后得到溶血液；S6、向溶血液中加入0-4℃的乙醇溶液，再加入0-4℃的氯仿，然后搅拌、静置、离心后收集上清液获得粗酶液，向粗酶液中加入丙酮，然后搅拌、离心，取沉淀物；S7、将步骤S6得到的沉淀物用磷酸盐缓冲液溶解，搅拌、离心后获得上清液，通过透析除去盐离子，得上清液C；S8、合并上清液A和上清液C，得到混合液，对混合液进行超滤浓缩，得到浓缩液，将浓缩液加热升温，调节pH值为8.5-9.0，并添加保护剂保温，保温后冷却，离心去除沉淀得到上清液D；S9、将上清液D溶解于含有乙醇的去离子水中，得到SOD粗溶液，以30-70ml/h的流速使SOD粗溶液通过改性层析柱，再用去离子水洗去改性层析柱内残留的SOD粗溶液；S10、用乙醇和氯化钠水溶液洗脱大孔弱碱离子交换树脂吸附的SOD粗溶液，收集流出液，浓缩、冷冻干燥即得纯化的超氧化物歧化酶。进一步的：所述步骤S3中，磷酸缓冲溶液的加入量为每千克内脏浆液中加入6-10L。进一步的：所述步骤S4中，提取液通过加热去除部分杂蛋白，加热温度为60-80℃，加热时间为60-140min。进一步的：所述步骤S5中，超声波破壁处理的超声功率为150-250W，超声时间为10-25min。进一步的：所述步骤S6中，乙醇溶液的加入量为20-40％溶血液的体积，氯仿的加入量为15-25％溶血液的体积，丙酮的加入量为粗酶液的3-4倍体积。进一步的：所述步骤S7中，离心机的转速为3000-5000r/min，离心时间为20-30min。进一步的：所述步骤S8中，保护剂为月桂酰氯，月桂酰氯的添加量为浓缩液质量的0.02-0.04％；保温时间为2-3h，保温后冷却至10-20℃，离心收集上清液，其中离心速度为5000-8000r/min。进一步的：所述步骤S9中，改性层析柱的制备方法为：取大孔弱碱离子交换树脂，转移至层析柱内，用酒精洗至层析柱内的流出液于水中不产生白色浑浊，用去离子水洗净层析柱内树脂的酒精，再用1N盐酸溶液对大孔弱碱离子交换树脂进行改性处理，得到改性层析柱。进一步的：所述步骤S10中，所述乙醇的浓度为40-50％，所述氯化钠水溶液的浓度为20-30％。超氧化物歧化酶简称SOD，是一种广泛存在于自然界的生物酶，按所含金属种类不同可分为铜锌SOD、锰SOD和铁SOD三种。SOD能催化清除超氧阴离子自由基的反应。自由基是具有不配对价电子的原子或原子团，分子或离子构成。在正常生理状况下，生物体内不断地产生自由基，自由基的产生与清除处于平衡状态。但在某些病理情况下，自由基产生量多时，就会对DNA、蛋白质和脂类等生物大分子造成损伤，导致机体疾病的产生。由于自由基具有高度的化学活性，是人体生命活动中多种生化反应的中间代谢产物，自由基攻击生物大分子导致组织损伤是许多疾病发生发展的根源。因而SOD在防御生物体免受超氧阴离子自由基损伤，抗辐射，抗肿瘤及延缓机体衰老等方面具有重要的作用。SOD具有清除机体代谢过程中产生过量的超氧阴离子自由基的作用，可以延缓由于自由基侵害而出现的衰老现象，即延缓皮肤衰老和脂褐素沉淀的出现。衰老自由基学说认为衰老是来自机体正常代谢过程中所产生的自由基随机附带破坏性的作用结果，自由基引起机体衰老的主要机制可概括为以下三方面:(1)减少生物大分子的交联聚合和脂褐素的堆积；(2)减缓器官组织细胞的损伤与减少；(3)防止免疫能力的降低。SOD可以提高人体对自由基损伤而诱发疾病的抵抗力自由基损伤而诱发疾病的抵抗力主要包括肿瘤、炎症、肺气肿、白内障和自身免疫疾病等当SOD作为功能性食品基料加入食品中时，可有效抑制许多疾病的发生、发展，对人体健康有极大作用。SOD还可以清除机体疲劳，增强对超负荷大运动量的适应力的作用。在超负荷大运动量过程中，机体中部分组织细胞会交替出现暂时性缺血及重灌流现象，引起缺血后重灌流损伤，加之乳酸量的增加，导致肌肉的疲劳与损伤。若在运动前供给SOD，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种海洋生物源超氧化物歧化酶提取分离工艺，其特征在于，具体包括以下步骤：S1、取新鲜的海鱼，取出内脏和鱼血，将内脏清洗干净，沥干后备用，往鱼血中加入5‑10％鱼血质量的柠檬酸钠，混合均匀后冷藏备用；S2、将清洗干净的内脏进行打浆，得到内脏浆液；S3、往内脏浆液中加入磷酸缓冲溶液，调节提取液pH6.5‑7.5，40‑60℃下搅拌提取2‑6h，得到内脏提取液；S4、对内脏提取液进行加热去除杂蛋白，后离心去除沉淀，得上清液A；S5、将鱼血置于离心机中离心，沉淀物用生理盐水洗涤，制得红细胞，用超声波破壁处理，加入去离子水，冰浴下静置后得到溶血液；S6、向溶血液中加入0‑4℃的乙醇溶液，再加入0‑4℃的氯仿，然后搅拌、静置、离心后收集上清液获得粗酶液，向粗酶液中加入丙酮，然后搅拌、离心，取沉淀物；S7、将步骤S6得到的沉淀物用磷酸盐缓冲液溶解，搅拌、离心后获得上清液，通过透析除去盐离子，得上清液C；S8、合并上清液A和上清液C，得到混合液，对混合液进行超滤浓缩，得到浓缩液，将浓缩液加热升温，调节pH值为8.5‑9.0，并添加保护剂保温，保温后冷却，离心去除沉淀得到上清液D；S9、将上清液D溶解于含有乙醇的去离子水中，得到SOD粗溶液，以30‑70ml/h的流速使SOD粗溶液通过改性层析柱，再用去离子水洗去改性层析柱内残留的SOD粗溶液；S10、用乙醇和氯化钠水溶液洗脱大孔弱碱离子交换树脂吸附的SOD粗溶液，收集流出液，浓缩、冷冻干燥即得纯化的超氧化物歧化酶。...

【技术特征摘要】
1.一种海洋生物源超氧化物歧化酶提取分离工艺，其特征在于，具体包括以下步骤：S1、取新鲜的海鱼，取出内脏和鱼血，将内脏清洗干净，沥干后备用，往鱼血中加入5-10％鱼血质量的柠檬酸钠，混合均匀后冷藏备用；S2、将清洗干净的内脏进行打浆，得到内脏浆液；S3、往内脏浆液中加入磷酸缓冲溶液，调节提取液pH6.5-7.5，40-60℃下搅拌提取2-6h，得到内脏提取液；S4、对内脏提取液进行加热去除杂蛋白，后离心去除沉淀，得上清液A；S5、将鱼血置于离心机中离心，沉淀物用生理盐水洗涤，制得红细胞，用超声波破壁处理，加入去离子水，冰浴下静置后得到溶血液；S6、向溶血液中加入0-4℃的乙醇溶液，再加入0-4℃的氯仿，然后搅拌、静置、离心后收集上清液获得粗酶液，向粗酶液中加入丙酮，然后搅拌、离心，取沉淀物；S7、将步骤S6得到的沉淀物用磷酸盐缓冲液溶解，搅拌、离心后获得上清液，通过透析除去盐离子，得上清液C；S8、合并上清液A和上清液C，得到混合液，对混合液进行超滤浓缩，得到浓缩液，将浓缩液加热升温，调节pH值为8.5-9.0，并添加保护剂保温，保温后冷却，离心去除沉淀得到上清液D；S9、将上清液D溶解于含有乙醇的去离子水中，得到SOD粗溶液，以30-70ml/h的流速使SOD粗溶液通过改性层析柱，再用去离子水洗去改性层析柱内残留的SOD粗溶液；S10、用乙醇和氯化钠水溶液洗脱大孔弱碱离子交换树脂吸附的SOD粗溶液，收集流出液，浓缩、冷冻干燥即得纯化的超氧化物歧化酶。2.根据权利要求1所述的一种海洋生物源超氧化物歧化酶提取分离工艺，其特征在于，所述步骤S3中，磷酸缓冲溶液的加入量为每千克内脏浆液中加入6-10L。3.根据权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪鹏志，周春霞，刘唤明，杨萍，邓楚津，
申请(专利权)人：广东海洋大学，
类型：发明
国别省市：广东,44