一株敲除FBP1基因的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一株敲除FBP1基因的酿酒酵母基因工程菌，属于微生物基因工程领域。本方法利用金担子素抗性标记AurR基因构建了FBP1基因敲除组件并成功转化酿酒酵母酵母菌株。本发明专利技术还公开了基因工程菌的构建方法。本发明专利技术进一步地公开了基因工程菌在固定化发酵生产模型中的应用。本发明专利技术使酿酒酵母在游离发酵中絮凝特性明显减弱，在固定化发酵中形成的生物被膜减少，黏附性降低，游离细胞明显增多。

【技术实现步骤摘要】
一株敲除FBP1基因的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一株敲除FBP1基因的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用。
技术介绍
生物膜是一种由微生物细胞和其分泌的胞外基质共同组成的生物聚集体，以其独特的微菌落形态和极高的环境抗性而受到人们的重视。作为生物膜的一种重要的工业应用，固定化发酵过程中细胞形成的生物膜，固定化细胞成膜后对发酵生产表现出较高的底物耐受性和较快的发酵效率。发酵过程的连续化和发酵效率的大幅提高。通常条件下，常规的游离细胞发酵50g葡萄糖大约需要8个小时左右，而我们的固定化细胞只需要6个小时就可以将糖转化为乙醇。随着发酵批次的增加，固定化发酵体系会最终到达一个最佳稳定状态，此时的固定化细胞可以以4个小时的稳定发酵周期持续进行几十个批次的发酵，展现了固定化细胞出色的发酵效率和良好的发酵稳定性。在考察高浓度初糖条件下，固定化细胞与游离细胞的发酵表现实验中，我们发现，固定化细胞拥有比游离细胞更高的底物/产物耐受性。一般来说，超过200g/L的葡萄糖就会对酵母细胞产生明显的毒害，而固定化细胞却可以在超过300g/L的葡萄糖环境中保持较高的细胞活力和发酵性能。因此如何合理调节固定化发酵中生物被膜的形成成为固定化发酵的重要一环。生物被膜作为固定化发酵的发酵单元，在工业上已被证明具有积极意义。在固定化发酵过程中，生物被膜的多少、厚薄都会影响其固定化发酵的效果。生物被膜量过少，发酵优势不明显，生物被膜量过多，会阻碍传质传导，从而影响发酵速度。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，提供一株敲除FBP1基因的酿酒酵母基因工程菌，针对原始酿酒酵母菌株絮凝特性强以及固定化发酵中生物被膜量多的特征，定向减弱其絮凝特征以及固定化发酵中生物被膜量。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一株敲除FBP1基因的酿酒酵母基因工程菌，该菌株中FBP1基因失活。FBP1基因是调控糖异生途径的关键基因，通过转录组数据分析在生物被膜形成的三个阶段中糖异生途径都明显富集，所以选取Fbp1基因作为改造对象。其中，所述酿酒酵母为SaccharomycescerevisiaeS288c。其中，敲除FBP1基因后，FBP1基因序列如SEQIDNO.2所示，所述FBP1基因敲除前的基因序列如SEQIDNO.3所示。上述敲除FBP1基因的酿酒酵母基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：(1)将敲除片段转化酿酒酵母菌株，所述敲除片段的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；(2)利用含有40μg/mL金担子素的YPD培养基筛选获得阳性转化子，得到敲除FBP1基因的酿酒酵母基因工程菌。作为优选，所述酿酒酵母菌株为SaccharomycescerevisiaeS288c。上述敲除FBP1基因的酿酒酵母基因工程菌作为发酵菌株的应用在本专利技术的保护范围之内。上述敲除FBP1基因的酿酒酵母基因工程菌在发酵制备乙醇中的应用在本专利技术的保护范围之内。有益效果：本专利技术公开了一种一株敲除FBP1基因的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用。由于原始菌株S288c在固定化发酵中生物被膜形成过多，阻碍了传质传导，导致发酵周期相应加长，敲除FBP1基因的酿酒酵母基因工程菌对比原始酿酒酵母菌株在游离发酵中絮凝特性明显减弱，在固定化发酵中形成的生物被膜减少，黏附性降低，游离细胞增多，加强了传质传导，减少了发酵周期。附图说明图1为本专利技术实施例1中Fbp1基因上、下游同源臂，AurR基因扩增片段及HO基因敲除组件的琼脂糖凝胶电泳图，其中，M：DNA分子量marker，1：Fbp1-kanMX(2766bp)，2：Fbp1L(540bp)，3：AurR基因扩增片段(1788bp)，4：Fbp1R(514bp)。图2为本专利技术实施例1中Fbp1基因缺失转化子的PCR鉴定电泳图，其中，M：DNA分子量marker；W为原始对照组，1、2分别为两个阳性转化子(2468bp)，3为阴性转化子。图3为本专利技术实施例2中原始菌S288c(W)与Fbp1基因敲除菌(△Fbp1)在96孔板培养3天孔板底部吸附菌体图。图4为本专利技术实施例3中原始菌S288c(W)与Fbp1基因敲除菌(△Fbp1)游离发酵中摇瓶的不同表征。图5为本专利技术实施例3中原始菌S288c与Fbp1基因敲除菌固定化发酵中摇瓶的不同表征。图6为本专利技术实施例3中原始菌S288c与Fbp1基因敲除菌在游离发酵与固定化发酵的发酵残糖数据。图7为本专利技术实施例3中原始菌S288c与Fbp1基因敲除菌在游离发酵与固定化发酵的发酵产物乙醇数据。具体实施方式实施例1：FBP1基因敲除酿酒酵母菌株的构建。以下实施例中用到的引物如下：AACGCTCTACCAACTGAGC(SEQIDNO:4，FBP1-up-F)ATTCTGGGCCTCCATGTCCGTCTGTAATTGCACTACTTGT(SEQIDNO:5，FBP1-up-R)AAGTAGTGCAATTACAGACGGACATGGAGGCCCAGAATAC(SEQIDNO:6，AurR-F)ACTGTGACTTGCCAATATGGCAGTATAGCGACCAGCATTC(SEQIDNO:7，AurR-F)ATGCTGGTCGCTATACTGCCATATTGGCAAGTCACAGTAG(SEQIDNO:8，FBP1-down-F)GCGAATTCATGTAGATCGCG(SEQIDNO:9，FBP1-down-F)ATTCTTAGTAGTCGCGGTCG(SEQIDNO:10，YZ-F)CAATGATGTGCAAGAACCCT(SEQIDNO:11，YZ-R)一、FBP1敲除组件的构建。(1)利用普通PCR扩增得到酵母FBP1基因的上、下游同源臂扩增片段(上同源臂扩增引物序列FBP1-up-F、FBP1-up-R如SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示；下同源臂扩增引物序列FBP1-down-F、FBP1-down-R如SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示)以及PYX212-AurR质粒中的AurR基因扩增片段(AurR基因扩增引物序列AurR-F、AurR-R如SEQIDNO:6和SEQIDNO:7所示)，通过琼脂糖凝胶电泳，切胶回收三片段。(2)通过引物(如SEQIDNO:4和SEQIDNO:9所示)对上述三个片段进行特异性扩增，通过琼脂糖凝胶电泳，切胶回收得到酿酒酵母FBP1基因敲除组件。二、酿酒酵母菌株感受态制备。(1)挑取酿酒酵母菌株接种YPD液体培养基，于30℃200r/min过夜培养，得活化种子液；(2)按照体积比10％的接种比例，将种子液转接至100mL新鲜的YPD液体培养基，于30℃200r/min继续培养至菌液OD600在0.8～1.2之间；(3)冰水浴预冷30min，低温高速离心机4℃5000r/min离心5min收集菌体；(4)用10mL4℃的无菌水重悬菌体，低温高速离心机4℃5000r/min离心5min收集菌体重复两次；用10mL4℃的1M山梨醇溶液重悬菌体，低温高速离心机5000r/min、4℃离心5min收集菌体重复三次；(5)1mL1M山梨醇重悬菌体，90μL一管分装。三、酿酒酵母菌株感转化及转化子的鉴定。(1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株敲除FBP1基因的酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，该菌株中FBP1基因失活。

【技术特征摘要】
1.一株敲除FBP1基因的酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，该菌株中FBP1基因失活。2.根据权利要求1所述敲除FBP1基因的酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母为SaccharomycescerevisiaeS288c。3.根据权利要求1所述敲除FBP1基因的酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，敲除FBP1基因后，FBP1基因序列如SEQIDNO.2所示。4.权利要求1所述敲除FBP1基因的酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将敲除片段转化酿酒酵母菌株，所述敲除片段的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；(2)利用含有40μg/mL金担子素的YPD培养基筛选...

【专利技术属性】
技术研发人员：应汉杰，奚迅，陈勇，刘娜，任培芳，孙文俊，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32