片段缩合制备索马鲁肽的方法技术

一种制备索马鲁肽的方法，本发明专利技术采用固液相结合片段缩合的方案，固相合成侧链保护肽，液相进行片段缩合得到全保护索马鲁肽，然后裂解得到索马鲁肽粗肽，纯化换盐得到索马鲁肽；为了减少消旋造成的副产物，本发明专利技术使用了伪脯氨酸策略。本发明专利技术方法，减少了杂质，提高了产率，同时缩短了合成时间，减少了废液排放，大幅降低了合成成本，非常有利于产业化生产。

【技术实现步骤摘要】
片段缩合制备索马鲁肽的方法
本专利技术涉及制药领域，具体地说涉及片段缩合制备索马鲁肽的方法。
技术介绍
索马鲁肽(Semaglutide)是诺和诺德公司开发的新型长效GLP-1类似物，序列为：H-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(AEEAc-AEEAc-γ-Glu-17-carboxyheptadecanoyl)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH，分子式：C187H291N45O59。能抑制DPP-4酶的水解，延长生物半衰期，长效降低血糖，促进胰岛细胞再生，用于治疗2型糖尿病。专利CN103848910、专利CN104356224、专利CN105753964、专利CN106928343、专利CN106478806、专利CN108203462、专利CN108359006、专利CN108676087和专利CN109021092是采用Fmoc策略固相法依次连接合成索马鲁肽。该方法氨基酸逐个偶联合成周期长，逐步偶联时树脂收缩严重、反应不完全、产生缺陷肽，固相载体选用的取代值限制，总收率较低，同时杂质较多，纯化困难。专利CN108059666采用固相片段缩合的方法合成，固相片段缩合投入的每个片段都是2-5倍过量，严重浪费肽片段，造成合成成本很高；同时固相片段缩合的树脂取代值限制，物料通量降低，浪费溶剂，产生大量废液。由于索马鲁肽的序列较长，属于中长肽，所以采用纯液相合成不是常规手段。如上所述，目前的主要手段以固相逐个缩合或固相片段缩合为主，这对于合成31个氨基酸的索马鲁肽来说，是可以得到产物的，但是，收率不高，实际上的收率在15-35％之间。所以本领域技术人员仍然期待以高产品收率、低合成成本获得具有良好品质产品的方法，尤其是降低成本、减少废液产生的新方法，对于大规模、产业化生产是非常必要和重要的。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有方法合成收率低、生产成本高、产生废液多、产品纯化难、不能低成本高效率得到高纯度的索马鲁肽的缺点，提供一种片段缩合制备索马鲁肽的方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：一种片段缩合制备索马鲁肽的方法，固相合成3个侧链保护的肽片段序列，将各肽片段在溶液体系中逐步偶联得到全保护索马鲁肽，然后裂解脱除保护基得到索马鲁肽粗肽，纯化换盐得到索马鲁肽；其中，所述的3个肽片段序列为：第一肽片段序列为索马鲁肽序列中的第1-12位氨基酸，侧链保护的第一肽片段序列为：Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(ψMe，MePro)-OH；第二肽片段序列为索马鲁肽序列中的第13-24位氨基酸，侧链保护的第二肽片段序列为：Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(AEEAc-AEEAc-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic(OtBu))-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-OH；第三肽片段序列为索马鲁肽序列中的第25-31位氨基酸，侧链保护的第三肽片段序列为：Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-OH。上述片段缩合制备索马鲁肽的方法，优选包括以下步骤：(1)分别固相合成侧链保护的第一～第三肽片段序列，并从树脂上裂解；(2)将侧链保护的第三肽片段序列羧基端修饰保护，并脱去其氨基保护基和侧链保护的第二肽片段序列偶联得到侧链保护的第四肽片段序列：Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(AEEAc-AEEAc-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic(OtBu))-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-OtBu。(3)将侧链保护的第四肽片段序列脱去氨基保护基，和侧链保护的第一肽片段序列偶联得到全保护的索马鲁肽：Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(ψMe，MePro)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(AEEAc-AEEAc-γ-Glu(OtBu)-Octadecanedioic(OtBu))-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-OtBu。(4)将全保护的索马鲁肽裂解脱除保护基得到索马鲁肽粗肽；(5)索马鲁肽粗肽经纯化换盐得到索马鲁肽。步骤(1)中，侧链保护的第一至第三肽片段序列分别由氨基酸依次偶联在固相载体上获得；其中，所述的固相载体为酸敏感树脂，优选为2-氯-三苯甲基氯树脂。侧链保护的第一至第三肽片段序列固相合成中，所使用的氨基脱保护试剂为体积百分含量为20％的哌啶的DMF溶液、或者体积百分含量为l％的DBU的DMF溶液；优选体积百分含量为20％哌啶的DMF溶液。所使用的偶联剂为DIC与HOBt按摩尔比1∶1的组合、或者HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1∶1∶2的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA按摩尔比1∶1∶2的组合；优选HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1∶1∶2的组合；待偶联的氨基酸与HOBt的摩尔比是1∶1。所使用的裂解剂为体积百分含量为0.5～1％的TFA的DCM溶液、或者体积百分含量为20％的TFE的DCM溶液、或者TFE与AcOH与DCM按照体积比1∶2∶7的混合物，优选体积百分含量为0.5～1％的TFA的DCM溶液。步骤(1)中，具体的固相合成方法，为本领域技术人员的常规技术手段。步骤(2)中，所使用的羧基端保护试剂为0.5M的2-Cl-TrtCl的DCM溶液或者CHCl3与TFE与TBTA按照体积比7∶2∶1的混合物，优选为CHCl3与TFE与TBTA按照体积比7∶2∶1的混合物。步骤(2)、(3)中，所使用的氨基脱保护试剂为体积百分含量为16％的哌啶的DMF溶液，或者体积百分含量为1％的DBU的DMF溶液。优选体积百分含量为16％哌啶的DMF溶液。步骤(2)、(3)中，所使用的偶联剂为HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1∶1∶2的组合、或者HBTU与HOAt与DIEA按摩尔比1∶1∶2的组合、或者DIC与HOBt按摩尔比1∶1的组合、或者EDC与HOBt按摩尔比1∶1的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA按摩尔比1∶1∶2的组合。优选HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1∶1∶2的组合。待偶联的羧基端与氨基端的摩尔比是0.95～1.05∶1。待偶联的羧基端与HOBt的摩尔比是1∶1。偶联反应的溶剂为DMF、DCM、NMP、T本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.片段缩合制备索马鲁肽的方法，其特征在于，固相合成3个侧链保护的肽片段序列，将各肽片段在溶液体系中逐步偶联得到全保护索马鲁肽，然后裂解脱除保护基得到索马鲁肽粗肽，纯化换盐得到索马鲁肽；其中，所述的3个肽片段序列为：第一肽片段序列为索马鲁肽序列中的第1‑12位氨基酸，第二肽片段序列为索马鲁肽序列中的第13‑24位氨基酸，第三肽片段序列为索马鲁肽序列中的第25‑31位氨基酸。

【技术特征摘要】
1.片段缩合制备索马鲁肽的方法，其特征在于，固相合成3个侧链保护的肽片段序列，将各肽片段在溶液体系中逐步偶联得到全保护索马鲁肽，然后裂解脱除保护基得到索马鲁肽粗肽，纯化换盐得到索马鲁肽；其中，所述的3个肽片段序列为：第一肽片段序列为索马鲁肽序列中的第1-12位氨基酸，第二肽片段序列为索马鲁肽序列中的第13-24位氨基酸，第三肽片段序列为索马鲁肽序列中的第25-31位氨基酸。2.根据权利要求1所述的片段缩合制备索马鲁肽的方法，其特征在于，它包括以下步骤：(1)分别固相合成侧链保护的第一～第三肽片段序列，并从树脂上裂解；(2)将侧链保护的第三肽片段序列羧基端修饰保护，并脱去其氨基保护基和侧链保护的第二肽片段序列偶联得到侧链保护的第四肽片段序列；(3)将侧链保护的第四肽片段序列脱去氨基保护基，和侧链保护的第一肽片段序列偶联得到全保护的索马鲁肽；(4)将全保护的索马鲁肽裂解脱除保护基得到索马鲁肽粗肽；(5)索马鲁肽粗肽经纯化换盐得到索马鲁肽。3.根据权利要求2所述的片段缩合制备索马鲁肽的方法，其特征在于，步骤(1)中，侧链保护的第一至第三肽片段序列分别由氨基酸依次偶联在固相载体上获得；其中，所述的固相载体为酸敏感树脂；侧链保护的第一至第三肽片段序列固相合成中，所使用的氨基脱保护试剂为体积百分含量为20％的哌啶的DMF溶液、或者体积百分含量为1％的DBU的DMF溶液；所使用的偶联剂为DIC与HOBt的组合、或者HBTU与HOBt与DIEA的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA的组合；所使用的裂解剂为体积百分含量为0.5～1％的...

【专利技术属性】
技术研发人员：常民，彭雅丽，王锐，薛宏祥，武怡菲，申宇轩，方泉，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62