一种新型抗菌肽及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物医药领域，涉及一种新型抗菌肽及其应用，该新型抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明专利技术的所述新型抗菌肽对革兰阳性菌和革兰阴性菌都具有广泛的杀灭活性，在小鼠体内切除创口模型和体外猪皮肤模型中证明了潜在的抗感染作用。

【技术实现步骤摘要】
一种新型抗菌肽及其应用
本专利技术属于生物医药领域，更具体地，涉及一种新型抗菌肽以及该新型抗菌肽在制备治疗皮肤和/或软组织感染的药物中的应用。
技术介绍
在过去的几十年里，门诊中出现了大量皮肤和软组织感染，表现为疖、痈、脓肿或蜂窝织炎。这种感染的主要致病菌是金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌是一种常见的革兰阳性菌，会导致多种疾病，从轻微的表面皮肤感染到危及生命的疾病。治疗这些皮肤和软组织感染的主要挑战是金黄色葡萄球菌耐药菌株迅速增加。随着金黄色葡萄球菌和其他微生物对抗生素耐药性的增加，迫切需要找到更有效的抗菌策略。抗菌肽具有广泛的对抗多种细菌和真菌的生物活性，有望成为新的抗菌策略首选药物。而且，与常规抗生素相比，抗菌肽产生耐药性的程度要小得多，因为抗菌肽杀死细菌的机制通常涉及攻击多个疏水性或阴离子靶标。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的上述缺陷，提供一种新型抗菌肽。本专利技术的所述新型抗菌肽(命名为抗菌肽PDK160)对革兰阳性菌和革兰阴性菌都具有广泛的杀灭活性，在小鼠体内切除创口模型和体外猪皮肤模型中证明了潜在的抗感染作用。本专利技术的第一方面提供一种新型抗菌肽，该新型抗菌肽的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示：AIPIKAIGKAGKLRAINIANFNFLKPKRK，其中，N端为硝基丙氨酸，C端为酰胺化末端。因此，所述新型抗菌肽可以表达为：NO2-AIPIKAIGKAGKLRAINIANFNFLKPKRK-NH2。所述硝基丙氨酸为甲基具有硝基取代基的丙氨酸，即，所述硝基修饰在丙氨酸的甲基上，取代甲基的一个氢原子。C端的酰胺化末端是指赖氨酸的羧基被酰胺化所形成的末端。上述修饰方式均为本领域常规的氨基酸修饰，修饰方法也可采用常规的各种方法。本专利技术对此并无特别限定。本专利技术的所述新型抗菌肽基于爪蟾素经过氨基酸突变获得，是指该抗菌肽基于爪蟾素设计得到。但在真正应用时，该抗菌肽可以通过人工合成得到。本专利技术中的所述新型抗菌肽为不含二级结构的小分子多肽，如不含α螺旋等高级复杂结构。本专利技术的第二方面提供上述新型抗菌肽的应用。具体地，本专利技术的第三方面提供上述新型抗菌肽在制备治疗皮肤和/或软组织感染的药物中的应用。本专利技术的第四方面提供上述新型抗菌肽在制备治疗革兰阳性菌或革兰阴性菌感染的药物中的应用。本专利技术的抗菌肽PDK160具有广谱杀菌活性。具体地，所述革兰阳性菌包括金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、疮疱丙酸杆菌、白假丝酵母、近平滑假丝酵母和克柔假丝酵母中的至少一种。具体地，所述革兰阴性菌包括大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和鲍氏不动杆菌中的至少一种。本专利技术的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。附图说明通过结合附图对本专利技术示例性实施方式进行更详细的描述，本专利技术的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。图1示出了PDK160对细菌细胞膜去极化强度的影响。图2示出了PDK160体内切除抗菌实验结果。图3示出了PDK160体外伤口抗菌实验结果。具体实施方式下面将更详细地描述本专利技术的优选实施方式。虽然以下描述了本专利技术的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本专利技术而不应被这里阐述的实施方式所限制。实施例中未注明具体条件者，皆按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实施例1、材料和方法1.1所需材料抗菌肽PDK160(NO2-AIPIKAIGKAGKLRAINIANFNFLKPKRK-NH2)由本实验室合成并保存。用莫匹罗星和夫西地酸(购自上海安瀚特生物医药技术有限公司)作为对照。体外耐药试验中，以庆大霉素(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)作为对照抗生素。本专利技术所用微生物均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号见表1。试验选取的无特定病原体小鼠及大鼠均购自北京华阜康生物科技股份有限公司(实验动物生产许可证号：BJXK(京)2013-0016；实验动物使用许可证号：BJXK(京)2016-0012)。人血红细胞购自上海血液生物医药有限责任公司。细胞毒性检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份公司；膜电位检测试剂盒、钙离子荧光探针购自碧云天生物技术有限公司；化学试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司；ThermoForma310CO2细胞培养箱购自美国ThermoScientific公司。1.2体外杀菌实验本专利技术试验了抗菌肽PDK160对金黄色葡萄球菌、链球菌、丙酸杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、几种假丝酵母的抑菌效果，采用微量杀菌浓度(MMC)法进行测定。将最小抗菌肽浓度导致减少≥99％的微生物被定义为MMC99。先将细菌在3.7％BHI培养基中37℃培养24h，再孵育2小时，达到指数生长时收集细菌悬液5000r/min离心5min，稀释成浓度为107CFU/ml的菌悬液。同样方法将抗菌肽PDK160稀释成最终浓度范围1.56-200μg/ml。96孔板中加入25μl细菌悬液，然后再加入5μl抗菌肽PDK160，37℃培养2h，所有样品均有重复，样品重复5孔。1.3溶血性试验采用新鲜人血红细胞测定PDK160的溶血活性。将红细胞与EDTA混合，5000r/min离心5分钟，用PBS清洗，5000r/min离心5分钟，重复三次，将最终红细胞的浓度调整为10％(v/v)。将实验所需要的抗菌肽用PBS稀释到浓度5-200μg/ml。将100μl红细胞悬浮液，50μl抗菌肽溶液和50μlPBS转移到圆孔96孔板，37℃培养1h，在5000r/min离心5分钟后将上清液转移到平底96孔板。测量上清液在540nm处的吸光度，观察血红蛋白的释放情况。用PBS(阴性对照)或0.1％TritonX-100(阳性对照)处理红细胞后的吸光度分别设为0和100％溶血。溶血的百分比计算通过使用下列公式：溶血率(％)＝100％×(Abs-Abs0％)/(Abs100％-Abs0％)。1.4耐药性实验制备金黄色葡萄球菌悬液，将其浓度调整为108CFU/ml。制备稀释的抗菌肽，浓度范围为0.75-96μg/ml。实验中，以庆大霉素做为阳性对照，持续时间为21天。1.5细胞质膜去极化的测定膜电位敏感的氰胺染料DiSC3(5)可以检测完整细菌细胞质膜上电势梯度的破坏情况。DiSC3(5)可以在细菌细胞中积累并自我抑制荧光。因此，荧光读数的增加反映了由于细胞膜渗透性的增加导致细菌细胞释放染料。具体测定方法为：制备金黄色葡萄球菌悬液，将其浓度调整为107CFU/ml。1ml细菌悬浮液中加入0.4mmolDiSC3(5)，制备浓度范围0.625-160μg/ml的PDK160，每1ml细菌悬浮液中加入100μlPDK160。在650nm波长和670nm波长下使用荧光分光光度计连续实时监测荧光强度，从添加PDK160开始，持续15分钟。1.6小鼠体内创面感染模型抗菌效果评价制备金黄色葡萄球菌悬液，将其浓度调整为109CFU/ml。用75％的酒精擦洗小鼠(6周龄，无特定病原体，雌雄性各一半，BALB/c系，共60只，随机分为4组，每组15只，体重平均为22g)的背部，每隔5mm做一个10mm×10mm的伤口，在伤口接种20μl细菌悬液。两小时，每个伤口添加100μlPDK160(浓本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型抗菌肽，其特征在于，该新型抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示：AIPIKAIGKAGKLRAINIANFNFLKPKRK，其中，N端为硝基丙氨酸，C端为酰胺化末端。

【技术特征摘要】
1.一种新型抗菌肽，其特征在于，该新型抗菌肽的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示：AIPIKAIGKAGKLRAINIANFNFLKPKRK，其中，N端为硝基丙氨酸，C端为酰胺化末端。2.根据权利要求1所述的新型抗菌肽，其特征在于，所述硝基丙氨酸为甲基具有硝基取代基的丙氨酸。3.根据权利要求1所述的新型抗菌肽，其特征在于，所述新型抗菌肽基于爪蟾素经过氨基酸突变获得。4.根据权利要求1所述的新型抗菌肽，其特征在于，所述新型抗菌肽为不含二级结构的小分子多肽。5.权利要求1-4...

【专利技术属性】
技术研发人员：张小蒙，周敏，
申请(专利权)人：江苏医药职业学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32