一种具有广谱抗菌活性的细菌素Gr17及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种具有广谱抗菌活性的细菌素Gr17及其应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。所述的细菌素Gr17的抗菌谱包括但不限于：李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aereu)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、热死环丝菌(Brochothrix thermosphacta)、大肠杆菌(Escherichia coli)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)、白色念珠菌(Candida albicans)。

【技术实现步骤摘要】
一种具有广谱抗菌活性的细菌素Gr17及其应用
本专利技术属于生物
，具体而言，涉及一种具有广谱抗菌活性的细菌素Gr17及其应用。
技术介绍
细菌素是核糖体合成的蛋白质和蛋白质复合物，对食源性病原体及相关物种具有抗菌作用(Cleveland等，2001)，但不会损害生产细胞的免疫蛋白(Diep等，2007)。由于无毒，高效和安全性的优点，乳酸菌(LAB)中的细菌素已被广泛用作蔬菜，肉类和其他食品中的食品防腐剂(Gálvez等，2007；Yang等，2014)。还有人提出，它们是未来抗生素的可行替代品(Cotter等，2012)。属于LAB属的肠球菌通常表征为革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性，兼性厌氧和非孢子形成菌(Moraes等，2013)。肠球菌是第一个发现在婴儿胃肠道(GIT)中的LAB(Fanaro等，2010)，在发酵食品和环境中也普遍存在(FoulquieMoreno等，2006)。一些其他的肠球菌属，在商业化和疾病治疗也有广泛应用。例如，屎肠球菌已用作食品生物防腐剂和腹泻治疗(Kathrani等，2016；Holzapfel等，2018)，粪肠球菌Symbioflor1具有治疗鼻窦炎或支气管炎的疗效(Habermann等人，2002)，屎肠球菌JWS833能够增强树突细胞上细胞因子的产生(Choi等人，2012)。因此，肠球菌在人类和动物，食品工业以及环境中发挥着很大的作用。可以从LAB生产许多抗微生物物质，例如有机酸，过氧化氢和细菌素。细菌素对敏感菌株表现出高度抑制活性。根据它们的结构，细菌素被分为四类(Klaenhammer，1993)。I类由耐热小肽(<5kDa)代表。II类含有热稳定的小的未修饰肽(5-10kDa)。III类包含分子大小超过30kDa的热不稳定蛋白质。IV类被表征为含有脂质或碳水化合物部分的蛋白质复合物。通常，IIa类由保守的YGNGV基序和二硫键连接组成(Perez等，2014)。肠球菌素是肠球菌属的细菌素。已经报道了许多产生肠球菌素的肠球菌和肠球菌素，例如来自E.faeciumCTC492的肠球菌素A(Aymerich等人，1996)，来自E.faeciumT136的肠球菌素B(Casaus等人，1997)，来自E.faeciumP13的肠球菌素P(Cintas等，1997b)，来自E.faeciumL50的肠球菌素Q(Cintas等，2000)。大多数IIa类肠球菌素被合成为具有N-末端信号肽的前体，其被ATP结合盒(ABC)转运蛋白(Havarstein等，1995)或Sec分泌系统(Cintas等，1997a)切割。N-末端信号肽的类型决定了肠球菌素的合成机制。虽然细菌素和生产细胞在食品工业中起着至关重要的作用，但对肠粘素的生物合成机制和实际应用的研究相对较少。
技术实现思路
在本专利技术中，我们从中国传统低盐发酵全鱼产品中分离的新菌株屎肠球菌Gr17，并测定了其完整基因组序列。此外，测定了纯化的肠球菌素Gr17的物理化学性质和抗菌活性。因此，屎肠球菌Gr17的基因组信息和肠球菌素Gr17的抗菌性能为食品工业中作为食品防腐剂的潜在用途提供了理论基础。本专利技术首先涉及一种细菌素Gr17，所述的细菌素Gr17的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术还涉及所述的细菌素Gr17在制备针对如下细菌的抑菌产品和/或杀菌产品中的应用：李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaereu)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、热死环丝菌(Brochothrixthermosphacta)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、阪崎肠杆菌(Enterobactersakazakii)、白色念珠菌(Candidaalbicans)。本专利技术还涉及所述的细菌素Gr17的生产方法，所述的方法包括如下步骤：(1)发酵所述细菌素Gr17的生产菌株粪肠球菌Gr17，分离发酵液；(2)硫酸铵沉淀发酵液后透析获得细菌素Gr17粗品；(3)离子交换层析法提纯细菌素Gr17粗品获得细菌素Gr17精制品(4)HPLC提纯细菌素Gr17精制品获得细菌素Gr17纯品。发酵生产菌株粪肠球菌Gr17的方法为：(1)将粪肠球菌Gr17接种在MRS培养基中，在37℃下培养至OD600＝0.3～0.6，获得种子液，培养过程不搅拌；(2)按0.5％(v/v)比例接种种子液到MRS培养基中，在37℃下发酵培养24小时，培养过程不搅拌。所述的硫酸铵沉淀发酵液后透析的方法为：使用4％硫酸铵溶液沉淀上清液，用超纯水透析脱盐。所述的离子交换层析法提纯粗品的步骤为：(1)用20mM磷酸盐缓冲液(pH5.5)平衡SP-SepharoseFastFlow阳离子交换柱，加样，然后用0MNaCl到1MNaCl的线性梯度洗脱，流速为1mL/min，收集约40min处级分；(2)用20mM磷酸盐缓冲液(pH5.5)平衡Sephadex层析柱，加样，然后用20mM磷酸盐缓冲液以0.5mL/min的流速洗脱，收集约30min处的级分。所述的HPLC提纯细菌素Gr17精制品的步骤为：使用C18反相柱，流动相含有0.1％三氟乙酸(TFA)的95％水-乙腈(5％-95％)进行线性梯度洗脱，流速为0.5mL/min，在280nm处监测吸光度，收集约20min处的级分。本专利技术还涉及发酵生产肠球菌素Gr17的粪肠球菌Gr17菌株，所述的菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCCNo.16677。本专利技术还涉及所述的粪肠球菌Gr17菌株在制备抑菌和/或杀菌产品中的应用。附图说明图1、肠球菌素Gr17的纯化过程检测谱图。图2、肠球菌素Gr17的质谱分子量具体实施方式样品和细菌培养条件样品来自中国贵州黎平侗族少数民族地区的中国传统低盐发酵全鱼产品“酸鱼”。所有LAB菌株均在MRS培养基中培养，37℃，无需搅拌。用于指示菌株的培养基列于表1中，在37℃下培养。将所有细菌在-80℃下储存在含有20％甘油(v/v)的培养液中。实施例1、产生细菌素的LAB的分离(1)将样品与无菌0.9％NaCl(80mL)混合。用无菌0.9％NaCl进行连续稀释，并将每种稀释液(100μL)涂布在MRS琼脂平板上，在37℃下培养24小时。(2)将约589个单细菌菌落在到2mLMRS培养基中，37℃下培养24小时。(3)将上清液在4℃下以8000g离心20分钟，重新调节至pH7.0，并通过0.22μm过滤器过滤获得仅含有分泌的细菌素(不含菌株)的上清液，通过用游标卡尺测量抑制圈的直径来检测细菌素的抗菌活性。(4)根据对指示菌株(单核细胞增生李斯特菌和大肠杆菌)的测试选出具有抗菌活性的菌株(22株)。(5)再进一步根据由其他指示菌株(金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌)测试得出的具有广谱抗菌谱和高抗菌活性的菌株命名为Gr17。实施例2、细菌素产生菌的DNA纯化和鉴定将菌株Gr17在37℃下(无需搅拌)在MR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细菌素Gr17，所述的细菌素Gr17的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

【技术特征摘要】
2018.11.03 CN 20181130424621.一种细菌素Gr17，所述的细菌素Gr17的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。2.权利要求1所述的细菌素Gr17在制备针对如下细菌的抑菌产品和/或杀菌产品中的应用：李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaereu)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、热死环丝菌(Brochothrixthermosphacta)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、阪崎肠杆菌(Enterobactersakazakii)、白色念珠菌(Candidaalbicans)。3.权利要求1所述的细菌素Gr17的生产方法，所述的方法包括如下步骤：(1)发酵所述细菌素Gr17的生产菌株粪肠球菌Gr17，分离发酵液；(2)硫酸铵沉淀发酵液后透析获得细菌素Gr17粗品；(3)离子交换层析法提纯细菌素Gr17粗品获得细菌素Gr17精制品(4)HPLC提纯细菌素Gr17精制品获得细菌素Gr17纯品。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，发酵生产菌株粪肠球菌Gr17的方法为：(1)将粪肠球菌Gr17接种在MRS培养基中，在37℃下培养至OD600＝0.3～0.6，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘国荣，王瑶，王成涛，李雪，郝旭，
申请(专利权)人：北京工商大学，
类型：发明
国别省市：北京,11