α螺旋自组装短肽及其在蛋白质纯化中的应用制造技术

本发明专利技术公开了α螺旋自组装短肽及其在蛋白质纯化中的应用，属于基因工程领域。该α螺旋自组装短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示。将该α螺旋自组装短肽与目的蛋白形成的融合蛋白在宿主细胞内表达后形成有活性的聚集体，通过表达所述融合蛋白来生产和纯化目的蛋白。本发明专利技术的α螺旋自组装短肽可以诱导融合蛋白形成大量的有活性的蛋白聚集体，纯化得到的目的蛋白产量和纯度都很高，而且该纯化方法对设备要求低，不需要纯化柱，生产成本低，操作简便，可应用于蛋白质的生产和纯化中。

【技术实现步骤摘要】
α螺旋自组装短肽及其在蛋白质纯化中的应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及α螺旋自组装短肽及其在蛋白质纯化中的应用。
技术介绍
利用基因重组技术表达外源蛋白在现代生物学技术的发展和应用中起着重要的作用，重组蛋白类生物制品在生物催化和生物医药领域的应用越来越广泛，利用原核系统重组表达生产酶制剂和多肽类药物已取得重大进展，但是，在原核系统中表达外源基因时，目的蛋白容易以不可溶的蛋白聚集体(包涵体)的形式存在[Williams,D.C.,etal.,CytoplasmicinclusionbodiesinEscherichiacoliproducingbiosynthetichumaninsulinproteins.Science,1982.215(4533):p.687-9]。包涵体表达虽然可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解，但是对表达产物的活性不利，需要后续的变复性才能得到具有生物活性的功能蛋白，蛋白变复性技术存在成本高、收率低、技术复杂等问题[vonMaltzahn,G.,etal.,PositivelyChargedSurfactant-likePeptidesSelf-assembleintoNanostructures.Langmuir,2003.19(10):p.4332-4337]，限制了包涵体表达的应用。研究发现，目的蛋白和易于聚集的短肽融合表达可以使表达得到的包涵体具有活性，这一发现改变了人们对包涵体的看法[Garcia-Fruitos,E.,Inclusionbodies:anewconcept.MicrobCellFact,2010.9:p.80]、[Mitraki,A.,ProteinAggregation:FromInclusionBodiestoAmyloidandBiomaterials,inAdvancesinProteinChemistryandStructuralBiology,A.McPherson,Editor.2010,AcademicPress.p.89-125]、[García-Fruitós,E.,etal.,Bacterialinclusionbodies:makinggoldfromwaste.TrendsinBiotechnology,2012.30(2):p.65-70]，这种具有生物活性的包涵体可以避免复杂的蛋白复性操作，具有良好的应用前景。蛋白的分离纯化是重组生产蛋白中关键的一步，该步骤的技术难度和成本均高，据报道，重组蛋白的分离和纯化成本约占其全部成本的60％-80％[陈浩等人,中国生物工程杂志,2002.22(5):p.87-92]。目前最常用的蛋白分离纯化方法是亲和层析，但是其高昂的成本限制了其在工业中的应用。目的蛋白、内含肽和自组装短肽融合表达时可以诱导融合蛋白形成有活性的蛋白聚集体[Wu,W.,etal.,Activeproteinaggregatesinducedbyterminallyattachedself-assemblingpeptideELK16inEscherichiacoli.MicrobialCellFactories,2011.10(1):p.9]、[Zhou,B.,etal.,Smallsurfactant-likepeptidescandrivesolubleproteinsintoactiveaggregates.MicrobialCellFactories,2012.11(1):p.10]、[Wang,X.,etal.,Formationofactiveinclusionbodiesinducedbyhydrophobicself-assemblingpeptideGFIL8.MicrobCellFact,2015.14:p.88]，聚集体通过内含肽的自切割使得目的蛋白释放到上清中，这种蛋白质的分离纯化方法成本低、操作简单，在工业生产中具有良好的应用前景。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的是提供α螺旋自组装短肽及其在蛋白质纯化中的应用。本专利技术的目的通过以下技术方案实现。α螺旋自组装短肽，所述短肽是α螺旋自组装短肽，氨基酸序列如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3所示。所述α螺旋自组装短肽，在水中通过形成卷曲螺旋(colied-coil)结构实现自组装，colied-coil区域由重复的7个氨基酸残基组成。所述α螺旋自组装短肽是两亲性α螺旋自组装短肽，每7个氨基酸形成的螺旋表面划分为一个亲水面和一个疏水面，亲水面由亲水性氨基酸组成，疏水面由疏水性氨基酸组成。所述两亲性α螺旋自组装短肽是疏水面大于亲水面的两亲性α螺旋自聚集短肽，氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，结构如图1a所示，疏水面由4个疏水性氨基酸组成，亲水面由3个亲水性氨基酸组成，螺旋表面有两个相邻的带相反电荷的氨基酸，即左上半面由两个疏水L(亮氨酸)和两个疏水A(丙氨酸)组成，形成一个疏水面，右下半面由E(谷氨酸)、K(赖氨酸)和T(苏氨酸)三个亲水氨基酸组成，形成一个亲水面，E带负电，K带正电，有正负电荷的吸引作用，α螺旋通过疏水作用相互结合，通过带正负电荷的氨基酸的作用稳定这种结合。所述两亲性α螺旋自组装短肽是亲水面大于疏水面的两亲性α螺旋自聚集短肽，氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，结构如图1b所示，短肽是前两段七个氨基酸的串联重复，两个重复之间有两个A(丙氨酸)，丙氨酸的插入可以导致两个疏水界面的相转变，亲水面由4-5个氨基酸组成，疏水面由2-3个氨基酸组成，亲水面和疏水面交界处有3个带电的氨基酸，α螺旋通过疏水作用相互结合，通过带正负电荷的氨基酸的作用稳定这种结合。所述α螺旋自组装短肽可组装成三股的螺旋束，氨基酸序列如SEQIDNO:3所示，结构如图1c所示，E(谷氨酸)和K(赖氨酸)存在正负电荷的吸引作用，α螺旋通过疏水作用相互结合，通过交替的谷氨酸和赖氨酸的电荷作用稳定这种结合。以上所述的α螺旋自组装短肽在蛋白质纯化中的应用，包括以下步骤：(1)将重组表达构建体导入宿主细胞中；所述重组表达构建体包括编码融合蛋白的多核苷酸序列与表达控制序列；所述融合蛋白是所述α螺旋自组装短肽和目的蛋白通过接头连接得到；(2)培养步骤(1)所得宿主细胞，表达所述融合蛋白；所述α螺旋自组装短肽和目的蛋白形成的融合蛋白在宿主细胞表达后形成大量的有活性的蛋白聚集体。(3)裂解步骤(2)所得宿主细胞，离心去除上清，收集不可溶部分。在本专利技术的重组表达构建体中，编码所述融合蛋白的多核苷酸的序列与表达控制序列可操纵地连接以进行希望的转录及最终在宿主细胞中生产所述融合蛋白。合适的表达控制序列包括但不限于启动子、增强子、核糖体作用位点如核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、转录剪接序列、转录终止序列和稳定mRNA的序列等等。本专利技术用的表达构建体的载体包括那些在宿主细胞中自主复制的载体，如质粒载体；还包括能够整合到宿主细胞DNA中并和宿主细胞DNA一起复制的载体。可商购获得许多适于本专利技术的载体。在一个具体实施方案中，本专利技术的表达构建体衍生自Novagen公司的pET30a(+)。优选的，步骤(1)所述宿主细胞，其导入本专利技术的表达构建体，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.α螺旋自组装短肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示，所述α螺旋自组装短肽形成卷曲螺旋结构。

【技术特征摘要】
2018.12.12 CN 20181151826741.α螺旋自组装短肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3所示，所述α螺旋自组装短肽形成卷曲螺旋结构。2.权利要求1所述的α螺旋自组装短肽在蛋白质生产和纯化中的应用，其特征在于，包括以下步骤：（1）将重组表达构建体导入宿主细胞中；所述重组表达构建体包括编码融合蛋白的多核苷酸序列与表达控制序列；所述融合蛋白是所述α螺旋自组装短肽和目的蛋白通过接头连接得到；（2）培养步骤（1）所得宿主细胞，表达所述融合蛋白；（3）裂解步骤（2）所得宿主细胞，离心去除上清，收集不可溶部分。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（1）所述接头为GS型接头。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述接头的氨基酸序列如SEQIDNO:7所示。5.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：林章凛，仙丹华，杨晓锋，赵镭，王胥，周碧红，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44