本发明专利技术公开一种用于活体检测硝基还原酶的光声探针及其制备方法与应用，属于肿瘤标志物检测与成像领域。该用于活体检测硝基还原酶的光声探针的结构式如式I所示。该探针主要是以苯并Cy7‑Cl为原料通过亲核取代，克脑文盖尔缩合反应，氯甲酸酯亲核取代反应得到。本发明专利技术克服了荧光探针在活体检测中荧光信号的散射和组织吸收的问题，制备的探针具有光声信号穿透深度大，实现深层组织的成像，反应速度快，特异性好，比率检测更准确。该探针可以用于活体检测硝基还原酶，从而监控肿瘤的乏氧情况；或用于细胞中、生物样品中的硝基还原酶检测。
【技术实现步骤摘要】
用于活体检测硝基还原酶的光声探针及其制备方法与应用
本专利技术属于肿瘤标志物检测与成像领域，特别涉及一种用于活体检测硝基还原酶的光声探针及其制备方法与应用。
技术介绍
现在癌症己经成为影响人类健康的头号杀手，因此关于癌症的研宄是目前科研工作者工作中的重中之重。缺氧是实体肿瘤的特征之一。临床研究表明缺氧能够阻断许多种抗癌药物的新陈代谢过程，进而影响。抗癌药物的药效，且缺氧能够促进肿瘤细胞的转移。在宫颈癌及头颈部鱗状癌研究方面，缺氧在检测中甚至被认为是无进展生存信号，因此研究肿瘤细胞的缺氧状态具有很重要的临床意义(Kizaka-Kondoh,S.；Inoue,M.；Harada,H.；Hiraoka,M.T.CancerSci.2003,94,1021-1028.(5)Rofstad,E.K.；Rasmussen,H.；Galappathi,K.；Mathiesen,B.；Nilsen,K.；Graff,B.A.Hypoxiapromoteslymphnodemetastasisinhumanmelanomaxenograftsbyup-regulatingtheurokinase-typeplasminogenactivatorreceptor.CancerRes.2002,62,1847-1853.)。细胞中氧含量的降低将会促进还原应激效应，进而促进一些还原酶类的过表达，比如醌还原酶，硝基还原酶，偶氮还原酶。在它们之间，硝基还原酶的活性与肿瘤细胞的缺氧水平成正相关，因此在实际研宄中，研究人员往往将硝基还原酶作为代表研究肿瘤细胞的缺氧状态。硝基还原酶属于黄素酶的一员，它在电子供体NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)或者NADPH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)存在的情况下，能够将硝基芳香化合物中的硝基还原为相应的羟胺或氨基，这种还原行为为生物传感器的设计开辟了新的方向(Brown,J.M.；William,W.R.Nat.Rev.Cancer2004,4,437.)。此外，硝基还原酶还被用在了基因或者病毒导向的酶前体药物的癌症治疗及药物筛选方面，因此缺氧及硝基还原酶的检测对于药物研宄及肿瘤诊断具有重要的作用(Wilson,W.R.；Hay,M.P.Nat.Rev.Cancer2011,11,393.Chen,Y.；Hu,L.Med.Res.Rev.2009,29,29.)。传统的检测硝基还原酶的方法主要是电化学法，但是这种方法往往需要酶固定，不能够进行原位分析，因此不适用于活细胞成像。最近很多研究小组开始基于硝基芳烃设计荧光探针用于硝基还原酶检测和缺氧状态检测，并且成功实现了肿瘤活细胞的缺氧成像[(a)Cui,L.；Zhong,Y.；Zhu,W.；Xu,Y.；Du,Q.；Wang,X.；Qian,X.；Xiao,Y.Org.Lett.2011,13,928.(b)Guo,T.；Cui,L.；Shen,J.；Zhu,W.；Xu,Y.；Qian,X.Chem.Commun.2013,49,10820.(c)Yuan,J.；Xu,Y.；Zhou,N.；Wang,R.；Qian,X.；Xu,Y.RSCAdv.2014,4,56207.(d)Li,Z.；Li,X.；Gao,X.；Zhang,Y.；Shi,W.；Ma,H.Anal.Chem.2013,85,3926.(e)Li,Z.；He,X.；Wang,Z.；Yang,R.；Shi,W.；Ma,H.Biosens.Bioelectron.2015,63,112.(f)Xu,J.；Sun,S.；Li,Q.；Yue,Y.；Li,Y.；Shao,S.Analyst2015,140,574.]。此类方法的主要缺点是在活体检测中，生物组织对人体的生理组织对对超声信号的散射要比一般的光学信号低3～4个数量级，也就是说光声成像能提供更深成像深度和更高的成像分辨率。因此，合成一种特异性的硝基还原酶光声探针能够检测深层乏氧肿瘤组织中硝基还原酶，将实现了对生理组织中硝基还原酶更精确，无损，高分辨的检测具有重要意义。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一种用于活体检测硝基还原酶的光声探针。本专利技术的另一目的在于提供所述用于活体检测硝基还原酶的光声探针的制备方法。该制备方法主要是以苯并Cy7-Cl为原料通过亲核取代，克脑文盖尔缩合反应，氯甲酸酯亲核取代反应得到。本专利技术的又一目的在于提供所述用于活体检测硝基还原酶的光声探针的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种用于活体检测硝基还原酶的光声探针，其结构式如式I所示：所述的用于活体检测硝基还原酶的光声探针的制备方法，包括如下步骤：①在氮气保护下，将DMF溶于二氯甲烷中，得到DMF溶液；②将三氯氧磷溶于冰浴下的二氯甲烷中，然后将获得的三氯氧磷溶液加入到步骤①中得到的DMF溶液中，氮气保护下搅拌均匀，得到混合溶液；③将环己酮加入步骤②中得到的混合溶液中，进行回流反应，再将反应后获得的混合物倒入冰水中过夜，得到化合物A；④将1,2,2-三甲基苯并吲哚和碘甲烷溶于甲苯中，搅拌反应，反应结束后冷却至室温，过滤、洗涤，得到化合物B；⑤将步骤③中得到的化合物A、步骤④中得到的化合物B，以及乙酸钠溶于乙酸酐中，搅拌反应，反应结束后冷却至室温，过滤、洗涤、真空干燥，过硅胶柱纯化，得到苯并Cy7-Cl；⑥先将间苯二酚，碳酸钾加入无水乙腈中室温搅拌，再将苯并Cy7-Cl加入乙腈中加热搅拌，反应结束后，减压蒸干溶剂，过硅胶柱纯化，得到蓝绿色固体苯并Cy7-OH；⑦取过柱纯化后的苯并Cy7-OH溶于乙腈中，再加入对硝基苄基氯甲酸酯和三乙胺，室温搅拌，得到蓝紫色溶液，减压蒸干溶剂得到粗产物探针苯并Cy7-NO2，过硅胶柱纯化得到蓝紫色固体苯并Cy7-NO2，即用于活体检测硝基还原酶的光声探针。步骤①中所述的DMF优选为冰冻的DMF；DMF是指N,N-二甲基甲酰胺。步骤①中所述的DMF与二氯甲烷的体积比优选为1:1～1:2；更优选为1:1。步骤②中所述的三氯氧磷与二氯甲烷的体积比优选为1.05:1～1.3:1；更优选为1.05:1。步骤②中所述的三氯氧磷与所述DMF的体积比优选为1.05～1.3:2～2.7；更优选为1.05:2。步骤②中所述的搅拌的时间优选为30min。步骤③中所述的环己酮与所述混合溶液中三氯氧磷的体积比优选为1:2～2.5；更优选为1:2。步骤③中所述的回流反应的条件优选为于80℃条件下进行回流反应3h。步骤④中所述的1,2,2-三甲基苯并吲哚和碘乙烷的体积比优选为1:0.9～1.2；更优选为1:0.9。步骤④中所述的1,2,2-三甲基苯并吲哚用量为按每毫升甲苯配比0.2mL1,2,2-三甲基苯并吲哚计算。步骤④中所述的搅拌反应的条件优选为于100℃条件下搅拌反应20h。步骤④中所述的洗涤为采用乙酸乙酯进行洗涤。步骤⑤中所述的化合物A、化合物B和乙酸钠的摩尔比为0.6：1.3：0.6。步骤⑤中所述的化合物A用量为按每毫升乙酸酐配比0.2mmol化合物A计算。步骤⑤中所述的搅拌反应的条件优选为于60℃条件下搅拌反应3h。步骤⑤中所述的洗涤为依次用饱和碳酸氢钠溶液和水进行洗涤；优选为通过如下步骤实现：先用饱和碳酸氢钠溶本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于活体检测硝基还原酶的光声探针，其特征在于：该光声探针的结构式如式I所示：
【技术特征摘要】
1.一种用于活体检测硝基还原酶的光声探针，其特征在于：该光声探针的结构式如式I所示：2.权利要求1所述的用于活体检测硝基还原酶的光声探针的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：①在氮气保护下，将DMF溶于二氯甲烷中，得到DMF溶液；②将三氯氧磷溶于冰浴下的二氯甲烷中，然后将获得的三氯氧磷溶液加入到步骤①中得到的DMF溶液中，氮气保护下搅拌均匀，得到混合溶液；③将环己酮加入步骤②中得到的混合溶液中，进行回流反应，再将反应后获得的混合物倒入冰水中过夜，得到化合物A；④将1,2,2-三甲基苯并吲哚和碘甲烷溶于甲苯中，搅拌反应，反应结束后冷却至室温，过滤、洗涤，得到化合物B；⑤将步骤③中得到的化合物A、步骤④中得到的化合物B，以及乙酸钠溶于乙酸酐中，搅拌反应，反应结束后冷却至室温，过滤、洗涤、真空干燥，过硅胶柱纯化，得到苯并Cy7-Cl；⑥先将间苯二酚，碳酸钾加入无水乙腈中室温搅拌，再将苯并Cy7-Cl加入乙腈中加热搅拌，反应结束后，减压蒸干溶剂，过硅胶柱纯化，得到蓝绿色固体苯并Cy7-OH；⑦取过柱纯化后的苯并Cy7-OH溶于乙腈中，再加入对硝基苄基氯甲酸酯和三乙胺，室温搅拌，得到蓝紫色溶液，减压蒸干溶剂得到粗产物探针苯并Cy7-NO2，过硅胶柱纯化得到蓝紫色固体苯并Cy7-NO2，即用于活体检测硝基还原酶的光声探针。3.根据权利要求2所述的用于活体检测硝基还原酶的光声探针的制备方法，其特征在于：步骤①中所述的DMF与二氯甲烷的体积比为1:1～1:2；步骤②中所述的三氯氧磷与二氯甲烷的体积比为1.05:1～1.3:1；步骤②中所述的三氯氧磷与所述DMF的体积比为1.05～1.3:2～2.7；步骤③中所述的环己酮与所述混合溶液中三氯氧磷的体积比为1:2～2.5；步骤④中所述的1,2,2-三甲基苯并吲哚和碘乙烷的体积比为1:0.9～1.2；步骤④中所述的1,2,2-三甲基苯并吲哚用量为按每毫升甲苯配比0.2mL1,2,2-三甲基苯并吲哚计算；步骤⑤中所述的化合物A、化合物B和乙酸钠的摩尔比为0.6：1.3：0.6；步骤⑤中所述的化合物A用量为按每毫升乙酸酐配比0.2mmol化合物A计算；步骤⑥中所述的间苯二酚与碳酸钾，苯并Cy7-Cl三者间的当量比为2.6～3.5：2.6～3.5：1；步骤⑦中所述的苯并Cy7-OH与对硝基苄基氯甲酸酯和三乙胺的当量比为1：2.6：2.6。4.根据权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：张涛，邢达，马腾，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：广东,44
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。