一种番茄黄化曲叶病毒的快速检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种番茄黄化曲叶病毒的快速检测试剂盒，包括植物病毒DNA快速提取液和检测体系；所述植物病毒DNA快速提取液包括NaOH和Tris‑HCl；所述检测体系包括LAMP反应体系和金属离子指示剂检测液；所述LAMP反应体系包括LAMP反应液和LAMP检测引物。本发明专利技术提供的番茄黄化曲叶病毒的快速检测试剂盒，可快速检测到植物上的番茄黄化曲叶病毒，本发明专利技术提供的一种番茄黄化曲叶病毒的快速检测方法，可通过反应后溶液的颜色的变化快速诊断出疑似病株是否携带番茄黄化曲叶病毒。

【技术实现步骤摘要】
一种番茄黄化曲叶病毒的快速检测试剂盒及检测方法
本专利技术属于农业
，尤其涉及一种番茄黄化曲叶病毒的快速检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
番茄黄化曲叶病毒病是番茄生产上一种毁灭性病害，其主要毒源是番茄黄化曲叶病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV)，已给我国的番茄生产造成了严重的经济损失，因此，如何对TYLCV进行简单、快速、灵敏的检测，成为研究难点。目前在植物病毒的鉴定识别上常采用的方法：生物学实验，血清学检测，电子显微镜观察及分子生物学检测。而检测TYLCV常见的有2种方法，一是分子生物学检测方法，主要是利用PCR方法，但PCR检测耗时，产物不便检测，操作繁琐，反应需要PCR仪和特殊试剂，不适于田间检测使用。二是血清学检测方法，主要是ELISA方法，但ELISA的检测灵敏度上以及特异性不高，不适于快速准确检测。现有技术的不足主要有：部分引物不适于我国发生的TYLCV的检测，致使检测效率低，假阴性率高；没有明确提出取样部位和取样方法；需制备DNA，过程比较复杂，不易推广应用。环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是2000年由日本的荣研株式会专利技术的一种新的核酸扩增技术，因为其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为替代PCR的新的核酸扩增技术。其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶—BstDNApolymerase在恒温条件下(60～65℃)反应60分钟，即可完成核酸扩增。与常规PCR相比，不需要长时间的温度循环，不需要昂贵的PCR仪器，不需要繁琐的电泳及紫外观察过程。该技术是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。羟基萘酚蓝(hydroxylnaphtholblue，HNB)属于金属离子指示剂的一种。HNB是Mg2+的滴定剂，其颜色随溶液pH变化而改变，因此可以通过监测LAMP反应体系中Mg2+浓度的变化及溶液pH而起到颜色指示剂的作用。反应前将HNB加入到反应液中，反应体系呈紫色，反应过程中Mg2+与LAMP反应的副产物P2O74-结合产生大量沉淀，溶液中Mg2+浓度降低，pH发生变化，从而使HNB的颜色由紫色变为天蓝色。目前，LAMP技术已广泛应用于各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病监测和快速诊断。但是，目前尚无将LAMP技术应用在番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)的检测上。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术存在的以上问题，提供一种番茄黄化曲叶病毒的快速检测试剂盒，可快速检测到植物上的番茄黄化曲叶病毒，本专利技术提供的一种番茄黄化曲叶病毒的快速检测方法，可通过反应后溶液的颜色的变化快速诊断出疑似病株是否携带番茄黄化曲叶病毒。为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本专利技术通过以下技术方案实现：一种番茄黄化曲叶病毒的快速检测试剂盒，包括植物病毒DNA快速提取液和检测体系；所述植物病毒DNA快速提取液包括NaOH和Tris-HCl；所述检测体系包括LAMP反应体系和金属离子指示剂检测液；所述LAMP反应体系包括LAMP反应液和LAMP检测引物；所述LAMP检测引物包括四种反应引物，所述四种反应引物依次为：正向外引物F3：5'-GGTAAAGTCTGGATGGATGA-3'(序列1)；反向外引物B3：5'-TGTAGCATGAAATTTCCTCATC-3'(序列2)；正向内引物FIP：5'-GCTGTTTCCATAAGGCCTTCTATCGCAGAATCACACTAATCAGGT-3'(序列3)；反向内引物BIP：5'-CCAATGGATTTTGGACAGGTTTTTATCCCGCAAATCATTCTTCA-3'(序列4)；进一步地，所述NaOH的浓度为0.5M，所述Tris-HCl的pH值为8.0。进一步地，所述金属离子指示剂检测液为羟基萘酚蓝检测液。一种番茄黄化曲叶病毒的快速检测方法，该检测方法包括以下步骤：步骤a：检测体系的制备：取0.8μM的正向内引物FIP、0.8μM的反向内引物BIP、0.2μM的正向外引物F3、0.2μM的反向外引物B3、0.4mMdNTPs、1×ThermoPolBuffer、6mMMgCl2、2mMBetaine、8U的BstDNAPolymerase、180mM羟基萘酚蓝，加入超纯水制备成所述检测体系；步骤b：取待测病叶和0.5MNaOH，得混合物，将所述混合物放置于反应容器内，快速研磨所述混合物，得研磨液，将所述研磨液和Tris-HCl混合，制备得样品粗提总DNA提取液；步骤c：取1μl所述样品粗提总DNA提取液，加入到所述检测体系内，建立扩增体系，设置反应温度为60℃-65℃，反应时间为45min-75min，得到反应后溶液；步骤d：结果检测：包括可视化检测和试验判定。进一步地，所述病叶和所述0.5MNaOH的质量比为1：4。进一步地，所述研磨液和所述Tris-HCl的体积比为1：49。进一步地，所述试验判定的具体过程为：取3μL所述反应后溶液，经用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，检测是否出现扩增条带，若出现，则表示检测为阳性，即存在番茄黄化曲叶病毒，若未出现，则表示检测为阴性，即不存在番茄黄化曲叶病毒。进一步地，所述可视化检测的具体过程为：观察所述反应后溶液的颜色，天蓝色表示检测为阳性，即存在番茄黄化曲叶病毒；紫色表示检测为阴性，即不存在番茄黄化曲叶病毒。本专利技术的有益效果是：1、本专利技术提供的一种番茄黄化曲叶病毒的快速检测试剂盒，可快速检测到植物上的番茄黄化曲叶病毒，通过快速粗提取DNA，直接进行LAMP反应，具有简便、快速、灵敏、检测结果可视化等优势，应用本专利技术提供的快速检测试剂盒，对番茄黄化曲叶病毒病株进行检测可在1小时内完成，且LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，只需要一个水浴锅即可，不需要复杂的仪器设备和昂贵的分子试剂。2、本专利技术提供的一种番茄黄化曲叶病毒的快速检测方法，通过羟基萘酚蓝显色，结果肉眼直接可见，即：可通过反应后溶液的颜色的变化快速诊断出疑似病株是否携带番茄黄化曲叶病毒，该方法可在生产实践中对烟草、番茄、南瓜、木薯、棉花等重要经济作物上的番茄黄化曲叶病毒快速检测，同时可用于田间病害的早期诊断和病毒的监测和鉴定，操作简便易行。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本申请的一部分，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1是本专利技术提供的番茄黄化曲叶病毒的LAMP特异性检测结果图；图中，泳道M为marker，泳道1-5为感染番茄黄化曲叶病毒病植株，泳道6-14为未感染番茄黄化曲叶病毒病植株，泳道15为阴性；图2是本专利技术提供的番茄黄化曲叶病毒的不同Mg2+浓度的优化电泳图；图中，泳道M为marker，泳道1-5模板浓度分别为0、2、4、6、8mM，泳道6为阴性；图3是本专利技术提供的番茄黄化曲叶病毒的不同dNTP浓度的优化电泳图；图中，泳道M为marker，泳道1-5模板浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mM，泳道6为阴性；图4是本专利技术提供的番茄黄化曲叶病毒的不同反应温度的优化电泳图；图中，泳道M为marker，泳道1-5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种番茄黄化曲叶病毒的快速检测试剂盒，其特征在于：包括植物病毒DNA快速提取液和检测体系；所述植物病毒DNA快速提取液包括NaOH和Tris‑HCl；所述检测体系包括LAMP反应体系和金属离子指示剂检测液；所述LAMP反应体系包括LAMP反应液和LAMP检测引物；所述LAMP检测引物包括四种反应引物，所述四种反应引物依次为：正向外引物F3：5'‑GGTAAAGTCTGGATGGATGA‑3'；反向外引物B3：5'‑TGTAGCATGAAATTTCCTCATC‑3'；正向内引物FIP：5'‑GCTGTTTCCATAAGGCCTTCTATCGCAGAATCACACTAATCAGGT‑3'；反向内引物BIP：5'‑CCAATGGATTTTGGACAGGTTTTTATCCCGCAAATCATTCTTCA‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种番茄黄化曲叶病毒的快速检测试剂盒，其特征在于：包括植物病毒DNA快速提取液和检测体系；所述植物病毒DNA快速提取液包括NaOH和Tris-HCl；所述检测体系包括LAMP反应体系和金属离子指示剂检测液；所述LAMP反应体系包括LAMP反应液和LAMP检测引物；所述LAMP检测引物包括四种反应引物，所述四种反应引物依次为：正向外引物F3：5'-GGTAAAGTCTGGATGGATGA-3'；反向外引物B3：5'-TGTAGCATGAAATTTCCTCATC-3'；正向内引物FIP：5'-GCTGTTTCCATAAGGCCTTCTATCGCAGAATCACACTAATCAGGT-3'；反向内引物BIP：5'-CCAATGGATTTTGGACAGGTTTTTATCCCGCAAATCATTCTTCA-3'。2.根据权利要求1所述的一种番茄黄化曲叶病毒的快速检测试剂盒，其特征在于：所述NaOH浓度为0.5M，所述Tris-HCl的pH值为8.0。3.根据权利要求1所述的一种番茄黄化曲叶病毒的快速检测试剂盒，其特征在于：所述金属离子指示剂检测液为羟基萘酚蓝检测液。4.一种番茄黄化曲叶病毒的快速检测方法，其特征在于：该检测方法包括以下步骤：步骤a：检测体系的制备：取0.8μM的正向内引物FIP、0.8μM的反向内引物BIP、0.2μM的正向外引物F3、0.2μM的反向外引物B3、0.4mMdNTPs、1×ThermoPolBuffer、...

【专利技术属性】
技术研发人员：严丹侃，章东方，顾江涛，赵伟，戚仁德，李婷，
申请(专利权)人：安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所，
类型：发明
国别省市：安徽,34