一种中华绒螯蟹血细胞的培养基及其培养方法技术

本发明专利技术属于细胞培养技术领域，具体涉及一种中华绒螯蟹血细胞的培养基及其培养方法。所述中华绒螯蟹血细胞的培养基包括基础培养基和添加组分，其中，所述基础培养基选自TC‑100基础培养基；所述添加组分及其浓度如下：缓冲溶液1％‑10％；氯化钙1g·L

【技术实现步骤摘要】
一种中华绒螯蟹血细胞的培养基及其培养方法
本专利技术属于细胞培养
，具体涉及一种中华绒螯蟹血细胞的培养基及其培养方法。
技术介绍
中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)俗称“河蟹”，在我国分布十分广泛，是我国重要的养殖蟹类，具有较高的经济价值和很深的文化底蕴。近年来，随着中华绒螯蟹养殖规模的不断扩大，养殖面积和养殖密度的不断增大，产量的年年上升，造成了相关病害的不断发生，严重影响着中华绒螯蟹养殖业的健康稳定发展。血细胞在宿主免疫应答中起着重要作用，包括识别、吞噬、黑化、细胞毒性以及细胞间信息传递等。离体培养的血细胞，可进一步探究其造血和免疫机理。血细胞培养模型可以排除在体实验多种干扰因素的影响，在特定环境下研究目的因子对血细胞的作用。利用体外培养的血细胞建立多种病理生理模型，有利于从细胞和分子生物学水平研究蟹类疾病的发病机制和预防手段。在另一方面，随着基因组学、转录组学、蛋白组学、代谢组学等技术的不断发展，基因编辑技术的不断提高，蟹类的基因功能与分子育种研究极需其细胞系，然而目前蟹类的细胞培养技术不成熟，中华绒螯蟹的原代细胞培养还存在细胞形态差、存活率低、存活时间短，也极少分裂，不易传代等诸多问题，严重影响了中华绒螯蟹的基因功能研究和分子育种技术的发展，因此需要找到一种可以提高血细胞存活率，保护细胞形态的血细胞培养基制备的方法是具有重要的科研意义和现实价值的。
技术实现思路
鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种中华绒螯蟹血细胞的培养基及其培养方法，用于提高中华绒螯蟹血细胞体外培养的存活率。为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术是通过如下技术方案实现的。本专利技术的一方面提供一种中华绒螯蟹血细胞的培养基，所述培养基包括基础培养基和添加组分，其中，所述基础培养基选自TC-100基础培养基；所述添加组分及其浓度如下：在本专利技术的一些实施方式中，所述缓冲溶液选自1×PBS和/或HEPES缓冲溶液。在本专利技术的一些实施方式中，所述碱金属氯化物选自氯化钠和/或氯化钾。在本专利技术的一些实施方式中，所述抗生素选自双抗、青霉素和链霉素中的一种或多种的组合。在本专利技术的一些实施方式中，所述培养基的渗透压为900-1100mOsm/kg。本专利技术的另一方面提供所述培养基的制备方法，包括：提供TC-100基础培养基，向所述TC-100基础培养基中加入氯化钙、碱金属氯化物、葡萄糖和缓冲溶液，调节渗透压后加入抗生素溶液。本专利技术的另一方面提供所述的培养基在中华绒螯蟹血细胞培养方面的用途。本专利技术的另一方面提供一种中华绒螯蟹血细胞的培养方法，提供灭菌的中华绒螯蟹，抽取所述中华绒螯蟹足基膜处血淋巴，向所述血淋巴中加入抗凝剂混合均匀，冷冻离心，收集血细胞，弃上清并用缓冲溶液使细胞重悬，在细胞培养皿中接种细胞，并添加本专利技术所述的培养基。在本专利技术的一些实施方式中，所述足基膜是中华绒螯蟹第五步足足基膜。在本专利技术的一些实施方式中，所述中华绒螯蟹血细胞的培养方法还包括以下条件的任一项或多项：A1)所述血淋巴和抗凝剂的体积相等；A2)所述冷冻离心是于冷冻离心机0-4℃、2500-3000r/min冷冻离心3-5分钟；A3)所述培养基中的培养液24h更换1/2培养液。附图说明图1为本专利技术以TC-100为基础培养基培养的中华绒螯蟹血细胞形态显微图。图2为本专利技术选择不同培养基条件下血细胞存活率图。图3为本专利技术以TC-100为基础培养基在不同血清浓度条件下血细胞存活率图。图4为本专利技术实施例1长期培养的中华绒螯蟹血细胞存活率图。具体实施方式本专利技术专利技术人经过大量探索实验，提供了一种中华绒螯蟹血细胞培养基及其培养方法，显著地提高了中华绒螯蟹血细胞体外培养的存活率，延长了血细胞体外培养的时长，体外培养的血细胞可以保持良好的细胞形态，在此基础上完成了本专利技术。下面详细说明根据本专利技术中华绒螯蟹血细胞的培养基、培养基的制备方法及中华绒螯蟹血细胞的培养方法。本专利技术第一方面提供一种中华绒螯蟹血细胞的培养基，所述培养基包括基础培养基和添加组分，其中，所述基础培养基选自TC-100基础培养基；所述添加组分及其浓度如下：本专利技术所提供的中华绒螯蟹血细胞的培养基中，所述TC-100基础培养基包括无机盐、氨基酸、维生素、D(+)葡萄糖和胰蛋白胨汤等。本专利技术所提供的中华绒螯蟹血细胞的培养基中，所述TC-100基础培养基是由胰蛋白胨肉汤提供必需的生长因子。本专利技术所提供的中华绒螯蟹血细胞的培养基中，所述无机盐包括氯化钙二水合物、无水氯化镁、无水硫酸镁、氯化钾、碳酸氢钠、磷酸二氢钠等中的一种或多种的组合。本专利技术所提供的中华绒螯蟹血细胞的培养基中，所述氨基酸包括甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-胱氨酸盐酸盐、L-谷氨酸、L-组氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸二钠盐、L-缬氨酸等中的一种或多种的组合。本专利技术所提供的中华绒螯蟹血细胞的培养基中，所述缓冲溶液选自1×PBS和/或HEPES缓冲溶液。本专利技术所提供的中华绒螯蟹血细胞的培养基中，所述碱金属氯化物选自氯化钠和/或氯化钾。本专利技术所提供的中华绒螯蟹血细胞的培养基中，所述抗生素选自双抗、青霉素和链霉素中的一种或多种的组合。本专利技术所提供的中华绒螯蟹血细胞的培养基中，所述培养基的渗透压为900-1100mOsm/kg。本专利技术的第二方面提供前述培养基的制备方法，包括：提供TC-100基础培养基，向所述TC-100基础培养基中加入氯化钙、碱金属氯化物、葡萄糖和缓冲溶液，调节渗透压后加入抗生素溶液。在本专利技术所提供的培养基的制备方法中，TC-100基础培养基为0.9-1L。在本专利技术所提供的培养基的制备方法中，氯化钙的质量为1-2g。在本专利技术所提供的培养基的制备方法中，碱金属氯化物的质量为1-2g。在本专利技术所提供的培养基的制备方法中，葡萄糖的质量为1.5-2.5g。在本专利技术所提供的培养基的制备方法中，所述渗透压是利用渗透压仪将渗透压调节至900-1100mOsm/kg。在本专利技术所提供的培养基的制备方法中，调节渗透压后可以先用0.22微米的细菌过滤器过滤，再添加抗生素溶液。本专利技术第三方面提供前述的培养基在中华绒螯蟹血细胞培养方法方面的用途。本专利技术第四方面提供一种中华绒螯蟹血细胞的培养方法，包括提供灭菌的中华绒螯蟹，抽取所述中华绒螯蟹足基膜处血淋巴，向所述血淋巴中加入抗凝剂混合均匀，冷冻离心，收集血细胞，弃上清并用缓冲溶液使细胞重悬，在细胞培养皿中接种细胞，并添加本专利技术第一方面所述的培养基。本专利技术所提供的中华绒螯蟹血细胞的培养方法中，灭菌是选用75％的酒精擦拭体表进行灭菌。本专利技术所提供的中华绒螯蟹血细胞的培养方法中，所述抽取足基膜处血淋巴中，足基膜是中华绒螯蟹第五步足足基膜。本专利技术所提供的中华绒螯蟹血细胞的培养方法中，所述血淋巴和抗凝剂的体积相等，可以是用1000ul无菌注射器由实验用蟹的第五步足足基膜处抽取500-600ul血淋巴与等体积的抗凝剂混合均匀，防止血液凝结。本专利技术所提供的中华绒螯蟹血细胞的培养方法中，所述抗凝剂是由30mmol/L柠檬酸三钠、338mmol/L氢化钠、115mmol/L葡萄糖、1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种中华绒螯蟹血细胞的培养基，所述培养基包括基础培养基和添加组分，其中，所述基础培养基选自TC‑100基础培养基；所述添加组分及其浓度如下：

【技术特征摘要】
1.一种中华绒螯蟹血细胞的培养基，所述培养基包括基础培养基和添加组分，其中，所述基础培养基选自TC-100基础培养基；所述添加组分及其浓度如下：2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述缓冲溶液选自1×PBS和/或HEPES缓冲溶液。3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述碱金属氯化物选自氯化钠和/或氯化钾。4.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述抗生素选自双抗、青霉素和链霉素中的一种或多种的组合。5.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基的渗透压为900-1100mOsm/kg。6.根据权利要求1-5任一项所述的培养基的制备方法，包括：提供TC-100基础培养基，向所述TC-100基础培养基中加入氯化钙、碱金属氯化物、葡萄糖和缓冲溶液，调节渗透压后加入抗生素溶液。7.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨鹤，岳武成，陈晓雯，王军，王成辉，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：上海,31