以大菱鲆肌肉为基质的AOZ残留标准物质的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种以大菱鲆肌肉为基质的AOZ残留标准物质的制备方法，属于水产食品药物残留检测领域。所述制备方法为采用药浴方式对大菱鲆给药，呋喃唑酮在大菱鲆体内经过吸收、蓄积和代谢等过程后残留在肌肉组织中，获得具有其代谢产物AOZ残留的阳性基质原料，采用匀浆、冻干、磨粉、封装、杀菌等处理制备基体标准物质样品，并对其进行均匀性和稳定性验证。本发明专利技术采用药浴的方式，使呋喃唑酮在大菱鲆体内代谢生成AOZ，获取阳性标准物质原料，并通过匀浆、冻干制备步骤，获得具有良好均一性和稳定性的AOZ残留分析标准物质。本发明专利技术所制备的基体标准物质更接近实际检测样品的性质，以此标准物质评价检测方法、考察实验室间的差异、验证操作人员的结果准确性等工作更加科学准确。

【技术实现步骤摘要】
以大菱鲆肌肉为基质的AOZ残留标准物质的制备方法
本专利技术属于水产食品药物残留检测领域，特别是涉及一种以大菱鲆肌肉为基质的呋喃唑酮代谢物AOZ残留标准物质的制备方法。
技术介绍
硝基呋喃类药物是一类人工合成的具有5-硝基结构的广谱抗菌药，主要包括呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因等，曾被广泛用于治疗和预防由埃希氏菌和沙门氏菌引起的水生动物胃肠道疾病。硝基呋喃类药物在动物体内的半衰期短，但其代谢产物能与蛋白质紧密结合，残留时间长。研究证明，硝基呋喃类药物及其代谢物可诱导机体基因突变，特别是其代谢物具有强致癌性。出于安全性考虑，欧盟、美国等发达国家先后颁布了禁止使用该类兽药的禁令，我国农业部第193号公告《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》，明确禁止使用硝基呋喃类广谱抗菌药物。但硝基呋喃类药物由于价格低廉、疗效好，在水产养殖中仍存在违禁使用的现象。自2006年“多宝鱼(大菱鲆)药残风波”发生后，水产品中硝基呋喃类药物残留问题被暴露在大众面前。2015年媒体又报道山东等地多宝鱼体内检出违禁药物硝基呋喃等，对百姓餐饮生活产生很大影响。通过近年来的国家水产品例行监测结果显示，我国水产品中硝基呋喃类代谢物仍有一定程度检出，检出率最高的为呋喃唑酮代谢物(AOZ)和呋喃西林代谢物(SEM)，水产养殖中硝基呋喃类代谢物“禁而不止”的问题长期存在。作为分析过程质量保证的基础，标准物质分为纯品标准物质和基质标准物质。传统的纯品标准物质未考虑提取及分析过程中的基质效应及从组织中提取药物的效率，不能全面客观的评价分析方法的有效性。而基体标准物质由于具有与待测组织基本一致的生物环境，是确保药物残留量测定结果可靠性的重要工具。然而，通常水产品基体中药物残留标准物质都是通过在基质中直接添加药物来获得的，存在基质差异大、目标物结合状态不一样等缺陷。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于提供一种以大菱鲆鱼肉为基质的呋喃唑酮代谢物AOZ残留标准物质及其制备方法，该方法采用药浴方式对大菱鲆进行给药，是以呋喃唑酮在大菱鲆体内经过吸收、蓄积和代谢等过程后残留在肌肉组织中而制备的具有呋喃唑酮代谢产物AOZ残留的阳性基质原料。本专利技术提供的一种以大菱鲆肌肉为基质的AOZ残留标准物质的制备方法，包括大菱鲆基体标准物质原料的获取、基体标准物质样品的制备、基体标准物质样品的均匀性验证、基体标准物质样品的稳定性验证，具体步骤如下：(1)大菱鲆基体标准物质原料的获取将正常养殖体质健康的大菱鲆药浴前24h停止投喂饵料，选择呋喃唑酮药浴液，药浴液初始浓度为100～360ng/mL，药浴时间2h，停药后，取出大菱鲆，将表面残留的药物冲洗干净，取大菱鲆肌肉组织样品，获得的大菱鲆肌肉中AOZ的残留浓度为1.5～5μg/kg(3～10倍定量限)，并于-20℃条件下冷冻保存，获得大菱鲆基体标准物质原料；(2)基体标准物质样品的制备将大菱鲆肌肉组织经过包括匀浆、冻干、磨粉、封装、杀菌在内的处理，得到大菱鲆鱼肉基质的AOZ残留标准物质，大菱鲆冻干粉中AOZ残留量为6～20μg/kg。进一步，所述的匀浆：将冷冻保存大菱鲆肌肉组织样品，利用绞肉机进行匀浆；所述的冻干：将匀浆好的标准物质原料肉样，在-20℃冰箱中预冻后，将其放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥；所述的磨粉和混匀：取冷冻干燥后的样品，使用粉碎机进行磨粉，过40目筛板，并对样品进行进一步混匀处理；所述的封装和杀菌：采用带有密封内盖的棕色玻璃瓶进行样品的分装；封装过程中，充氮气保护，加盖密封并用铝袋真空分口包装，然后采用辐照灭菌法进行大菱鲆肌肉冻干粉样品的灭菌处理。(3)基体标准物质样品的均匀性验证按照整个封装过程的前、中、后随机抽取包装单元，对随机抽取的样品编号，每个随机抽取的单元再取3个平行，测定大菱鲆冻干鱼肉中AOZ残留量，结果采用方差分析法进行统计分析，通过比较F检验值与F临界值的大小来判断样品均匀性；(4)基体标准物质样品的稳定性验证稳定性验证包括长期稳定性和短期稳定性验证；长期稳定性：分别在第0、1、2、4、6个月开展长期稳定性检测研究；每次随机取3个包装单元，每个单元平行测定三次，取三个包装单元测量结果的平均值作为该次长期稳定性检测结果，并对结果统计分析；短期稳定性：采用将随机抽取的样品置于-20℃、4℃、25℃恒温箱中保存，分别在第0、3、6、9、12、15d进行短期稳定性监测，并对结果统计分析；(5)对经过步骤(3)、步骤(4)检验，均匀性和稳定性好的样品即为AOZ残留标准物质。本专利技术还提供一种利用上述方法制备的AOZ残留标准物质。本专利技术还提供一种利用上述方法制备的AOZ残留标准物质的应用。本专利技术与现有技术相比的有益效果：本专利技术通过对大菱鲆采取药浴方式给药，通过药物在动物体经过吸收、富集和代谢后获得具有药物残留的阳性基质原料，可靠性高。此标准物质更接近实际检测样品的性质，以此物质评价检测方法、考察实验室间的差异、验证操作员的结果准确性等工作更加科学准确。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、制备大菱鲆肌肉基质的呋喃唑酮代谢物AOZ残留标准物质按照如下步骤制备大菱鲆肌肉基质的AOZ残留标准物质：(1)大菱鲆基体标准物质原料的获取将体重为750±50g/尾的大菱鲆暂养在海水养殖系统中2周，养殖系统条件为：温度为16～18℃，盐度为31.7‰，溶解氧值为4.7mg/L，PH值为8.1，循环水体，连续充气。药浴前24h停止投喂饵料。选择呋喃唑酮药浴液初始浓度为100ng/mL，药浴时间2h，停药后，取出大菱鲆，用自来水将表面残留的药物冲洗干净。取大菱鲆肌肉组织样品，大菱鲆肌肉中AOZ的残留浓度为1.75μg/kg(3.5倍定量限)，并于-20℃条件下冷冻保存，获得大菱鲆基体标准物质原料。上述的检测方法中，所述定量限是指农业部783号公告-1-2006《水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定液相色谱-串联质谱法》规定的0.5μg/kg。(2)基体标准物质样品的制备将大菱鲆肌肉组织经过匀浆、冻干、磨粉、封装、杀菌等处理，即可得到所述大菱鲆鱼肉基质的AOZ残留标准物质，大菱鲆冻干粉中AOZ的残留浓度为7.0μg/kg。匀浆：将冷冻保存的大菱鲆肌肉组织样品，置于常温下解冻，为了便于样品粉碎，先将大菱鲆肌肉组织切成约1cm3大小的肉块，利用绞肉机进行匀浆。冻干：将匀浆好的标准物质原料肉样，均匀平铺于清洗干净的冷冻干燥盘中，在-20℃冰箱中预冻后，将其放入冷冻干燥机，冷冻干燥48h。磨粉和混匀：取出冷冻干燥盘中的样品，粉碎成5cm3的小块，使用粉碎机进行磨粉，过40目筛板。收集肌肉冻干粉，并对样品进行进一步混匀处理。封装和杀菌：采用带有密封内盖的棕色玻璃瓶进行样品的分装，每个包装单元按照每瓶5g冻干粉分装，共分装500瓶。分装前，每个样品瓶均经过酸泡、二次水冲洗、高纯水淋洗等清洗步骤，并在65℃下烘干，冷却到常温备用封装。封装过程中，充氮气保护，加盖密封并用铝带真空分口包装，并利用放射性同位素Co60的r-射线辐照灭菌法进行大菱鲆肌肉冻干粉样品的灭菌处理，辐照剂量为5.5kGy，辐照时间为4h。(3)基体标准物质本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种以大菱鲆肌肉为基质的AOZ残留标准物质的制备方法，其特征在于所述方法采用药浴方式对大菱鲆进行给药，是以呋喃唑酮在大菱鲆体内经过吸收、蓄积和代谢过程后残留在肌肉组织中而制备的具有呋喃唑酮代谢产物AOZ残留的阳性基质原料；将大菱鲆阳性基质原料经过包括匀浆、冻干、磨粉、封装、杀菌在内的处理，获得基体标准物质样品，并进行基体标准物质样品的均匀性和稳定性验证。

【技术特征摘要】
1.一种以大菱鲆肌肉为基质的AOZ残留标准物质的制备方法，其特征在于所述方法采用药浴方式对大菱鲆进行给药，是以呋喃唑酮在大菱鲆体内经过吸收、蓄积和代谢过程后残留在肌肉组织中而制备的具有呋喃唑酮代谢产物AOZ残留的阳性基质原料；将大菱鲆阳性基质原料经过包括匀浆、冻干、磨粉、封装、杀菌在内的处理，获得基体标准物质样品，并进行基体标准物质样品的均匀性和稳定性验证。2.根据权利要求1所述的一种以大菱鲆肌肉为基质的AOZ残留标准物质的制备方法，其特征在于所述方法包括大菱鲆基体标准物质原料的获取、基体标准物质样品的制备、基体标准物质样品的均匀性验证、基体标准物质样品的稳定性验证，具体步骤如下：(1)大菱鲆基体标准物质原料的获取将正常养殖体质健康的大菱鲆药浴前24h停止投喂饵料，选择呋喃唑酮药浴液，药浴液初始浓度为100～360ng/mL，药浴时间2h，停药后，取出大菱鲆，将表面残留的药物冲洗干净，取大菱鲆肌肉组织样品，获得的大菱鲆肌肉中AOZ的残留浓度为1.5～5μg/kg，并于-20℃条件下冷冻保存，获得大菱鲆基体标准物质原料；(2)基体标准物质样品的制备将大菱鲆肌肉组织经过包括匀浆、冻干、磨粉、封装、杀菌在内的处理，得到大菱鲆鱼肉基质的AOZ残留标准物质，大菱鲆冻干粉中AOZ残留量为6～20μg/kg。(3)基体标准物质样品的均匀性验证按照整个封装过程的前、中、后随机抽取包装单元，对随机抽取的样品编号，每个随机抽取的单元再取3个平行，测定大菱鲆冻干鱼肉中AOZ残留量，结果采用方差分析法...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢丽红，王敏，孙伟红，李兆新，周剑，杨梦瑞，翟毓秀，李沂光，宁劲松，彭吉星，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37