人和肽素快速定量检测方法与试剂盒技术

本发明专利技术提供一种基于MPs的全自动化学发光法检测CPP的方法，通过将普通免疫与免疫调节分子相结合，在常规普通免疫的同时辅助递送细胞因子Flt3l、mGM‑CSF和CCL20，得到具有高亲和力的抗体，并通过与磁分离相结合，磁珠具有较大的表面积与面积比，可以有效富集低浓度的CPP，从而实现了人血清中CPP快速、灵敏地测定。CPP的测定时间、灵敏度和特异性得到显著改善。

【技术实现步骤摘要】
人和肽素快速定量检测方法与试剂盒
本专利技术属于生物医学领域，特别涉及一种人和肽素快速定量检测方法与试剂盒。
技术介绍
为了应对各种疾病可以更加快速的诊断、更准确的预后评估和治疗决策的需求，催生了对新生物标志物的研究。精氨酸加压素(AVP)是下丘脑-垂体-肾上腺轴的主要激素之一。AVP系统可敏感感受身体暴露于内源性压力的刺激，其水平可灵敏反应机体在疾病状态下的受迫程度。然而，因为AVP不稳定，并且主要附着于血小板表面，分泌后又被机体迅速清除，因此，关于AVP检测方法学的可靠性存在质疑。和肽素(copeptin，CPP)是一种与精氨酸加压素(AVP)同源的包含39个氨基酸残基的多肽，是精氨酸加压素原(pro-VAP)的C端部分肽段。AVP系统激活后，刺激CPP以等摩尔量的AVP从脑后垂体分泌到循环中。因此，CPP直接反映AVP浓度，可用作AVP分泌的替代生物标志物。一项研究表明，CPP比循环皮质醇更能灵敏地反映机体压力水平。这种新的生物标志物将能够帮助在临床实践中做出早期决策，表现出与各种急性疾病状态的相关程度，如脑血管事件、心肌梗死、肺炎、肾脏疾病和高血压、渗透性改变、肥胖、甚至躁郁症、重度抑郁症、以及儿童期虐待等。在胸痛患者的分类中，除了肌钙蛋白之外，辅助CPP的测定，很好地改善了诊断性能。尤其是在胸痛发作后的早期，肌钙蛋白和CPP的联合测定提供了显着的阴性预测值，几乎与胸痛发作时间无关，因此有助于早期安全地排除心肌梗塞。在急性心肌梗死(AMI)的情况下，CPP迅速从垂体释放，并在几小时内开始恢复到正常水平，而肌钙蛋白T浓度仍然正常。在基于5,000个人的CPP诊断截止值的研究中，99％百分位数和18.9pmol/L作为通用定义的生物标志物的cut-off值，并且第97.5百分位数为13pmol/L，第95百分位数仅为9.8pmol/L。显然，监测CPP的及时性和敏感性非常重要。只有在确保检测灵敏度的同时尽可能缩短检测时间，才能使CPP的临床价值最大化。然而，到目前为止，仅有四种技术被用于确定CPP浓度，微管化学发光，放射免疫分析(RIA)，酶联免疫分析(ELISA)和电化学分析。虽然它们的灵敏度可以满足要求，但是检测时间太长，因此它仅用于科学研究，不用于临床。截至目前为止，CPP的即时检验(POCT)仍尚未报道，因此它在很大程度上限制了CPP的临床价值。
技术实现思路
基于此，本专利技术的目的在于提供一种可以用于临床分析的快速检测的人和肽素快速定量检测的试剂盒，且试剂盒的检测灵敏度和准确度高。为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种人和肽素快速定量检测的试剂盒，包含有：人和肽素单克隆抗体，所述抗人和肽素单克隆抗体由以下方法制备得到：以人和肽素抗原免疫小鼠；向免疫后的小鼠递送表达细胞因子的质粒；收集经质粒递送的小鼠的脾细胞或淋巴结细胞，并将所述脾细胞或淋巴结细胞与小鼠瘤细胞融合得到杂交瘤细胞，培养，分泌得抗人和肽素单克隆抗体。在其中一些实施例中，所述人和肽素抗原为含有氨基酸序列SEQIDNO:1，SEQIDNO:2或SEQIDNO:3的多肽；和/或所述人和肽素抗原为偶联有大分子蛋白的人和肽素抗原，优选地，所述大分子蛋白为KLH、OVA、BSA中的至少一种；和/或所述细胞因子包括mFlt3l、mGM-CSF和mCCL20。在其中一些实施例中，所述高亲和力的抗人和肽素单克隆抗体与磁微粒偶联，作为捕获抗体。在其中一些实施例中，所述试剂盒还包含有检测抗体，所述检测抗体与所述捕获抗体识别人和肽素的不同表位。在其中一些实施例中，碱性磷酸酶标记的人和肽素单克隆抗体、辣根过氧化酶标记的人和肽素单克隆抗体中的任一种。在其中一些实施例中，所述试剂盒中包含有：捕获抗体、检测抗体、人和肽素标准品和发光底物；所述捕获抗体为：磁微粒包被的高亲和力的抗人和肽素单克隆抗体；所述检测抗体为：酶标人和肽素单克隆抗体；所述发光底物经酶标人和肽素单克隆抗体上的酶催化后发光；所述检测抗体与所述捕获抗体识别人和肽素的不同表位。在其中一些实施例中，所述试剂盒使用时所述捕获抗体的稀释比例为1：(50～100)，所述检测抗体的稀释比例为1：(50～200)。优选地，该试剂盒中所述酶标人和肽素单克隆抗体为碱性磷酸酶标记的人和肽素单克隆抗体，所述发光底物为AMPPD。本专利技术还提供了一种人和肽素快速定量检测的方法，具体技术方案如下：一种人和肽素快速定量检测的方法，包括以下步骤：将捕获抗体分别加入待测样品中，孵育；加入检测抗体，形成夹心免疫复合物、检测；检测梯度浓度的人和肽素标准品制备标准曲线；根据标准曲线计算待测样品的浓度，即得；所述捕获抗体为权利要求1所述高亲和力的抗人和肽素单克隆抗体与磁微粒偶联得到；所述检测抗体为酶标记的人和肽素抗体，与所述捕获抗体识别的人和肽素的表位不同。在其中一些实施例中，所述捕获抗体的稀释比例为1：(50～100)，所述检测抗体的稀释比例为1：(50～200)；优选地，所述孵育的时长为30～50min，pH值为8～9。在其中一些实施例中，所述检测为化学发光法，包括：将所述夹心免疫复合物磁分离，洗涤去除多余的检测抗体，加入发光底物AMPPD，混匀，温育，测量发光值。基于上述技术方案，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术的专利技术人无意中发现，相对于普通免疫，将普通免疫与DNA免疫相结合对于免疫反应具有显著的调节作用，同时本专利技术在常规普通免疫的基础上，结合辅助递送表达细胞因子的质粒，从而增加免疫动物的免疫反应，提高机体内抗原分子的有效递呈，促进抗体有效成熟，进而得到具有高亲和力的抗体，所得到的抗体亲和力较常规方法制备得到的抗体高10～100倍；将上述抗体制备得到人和肽素快速定量检测的试剂盒，应用到和肽素免疫检测中，实现了在保证检测灵敏度的基础上大大缩短了检测时间，从而可有效实现和肽素的POCT应用，增加和肽素的临床应用价值，为重症监护和预后治疗提供更有效的参考指标。附图说明图1为高亲和力抗人和肽素单克隆抗体的制备技术路线；图2为8株稳定的杂交瘤阳性细胞对应制备得到的单克隆抗体凝胶电泳图；图3为实施例1制备得到的高亲和力抗体的效价测定结果图；图4～7为实施例1制备得到的高亲和力抗体的亚型鉴定结果；图8为实施例1制备得到的高亲和力抗体与普通抗体亲和力测定的结果；图9为高亲和力抗体与普通抗体用于细胞免疫组化试验的结果；图10为AP-mAbs和mAb-MPs使用浓度优化试验结果；图11为基质pH和孵育时间的优化试验结果；图12为利用高亲和力抗体基于MPs的全自动化学发光法检测CPP的化学发光标准曲线图；图13为应用稀释回收率评估方法准确性测试结果；图14为本专利技术的检测方法与市售的ELISA试剂盒检测进行比较的结果。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面将参照实施例对本专利技术进行更全面的描述，以下给出了本专利技术的较佳实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人和肽素快速定量检测的试剂盒，其特征在于，包含有：人和肽素单克隆抗体，所述抗人和肽素单克隆抗体由以下方法制备得到：以人和肽素抗原免疫小鼠；向免疫后的小鼠递送表达细胞因子的质粒；收集经质粒递送免疫的小鼠的脾细胞或淋巴结细胞，并将所述脾细胞或淋巴结细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞，培养，分泌得抗人和肽素单克隆抗体。

【技术特征摘要】
1.一种人和肽素快速定量检测的试剂盒，其特征在于，包含有：人和肽素单克隆抗体，所述抗人和肽素单克隆抗体由以下方法制备得到：以人和肽素抗原免疫小鼠；向免疫后的小鼠递送表达细胞因子的质粒；收集经质粒递送免疫的小鼠的脾细胞或淋巴结细胞，并将所述脾细胞或淋巴结细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞，培养，分泌得抗人和肽素单克隆抗体。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述人和肽素抗原为含有氨基酸序列SEQIDNO:1，SEQIDNO:2或SEQIDNO:3的多肽；和/或所述人和肽素抗原为偶联有大分子蛋白的人和肽素抗原，所述大分子蛋白为KLH、OVA、BSA中的至少一种；和/或所述细胞因子包括mFlt3l、mGM-CSF和mCCL20。3.根据权利要求1任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述高亲和力的抗人和肽素单克隆抗体与磁微粒偶联，作为捕获抗体。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含有检测抗体，所述检测抗体与所述捕获抗体识别人和肽素的不同表位。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述检测抗体为：碱性磷酸酶标记的人和肽素单克隆抗体、辣根过氧化酶标记的人和肽素单克隆抗体中的任一种。6.根据权利要求1～5任一项所述的试剂盒，其特征在于，包含有：捕获抗体、检测抗体、人和肽素标准品和发光底物；所述捕获抗体为：磁微粒包被的高亲和力的抗人和肽...

【专利技术属性】
技术研发人员：王羽，康业，崔跃，吴培钿，何小维，王继华，
申请(专利权)人：广州万孚生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44