一种苔藓植物外植体的消毒方法技术

本发明专利技术公开了一种杀菌效果好、消毒废液不污染环境且对人体无害、毒性小、不易损伤苔藓植物的苔藓植物外植体的消毒方法。该消毒方法通过对苔藓外植体清洗后，接着将外植体依次经过酒精、次氯酸钠、酒精、次氯酸钠浸泡消毒处理，然后利用无菌水清洗干净后放入培养皿中，培养14‑21天至培养基表面形成原丝体和茎叶体，剪取培养基表面形成的原丝体和茎叶体，并依次经过酒精、次氯酸钠、酒精、次氯酸钠浸泡消毒处理，最后再利用无菌水清洗干净后即可得到无菌的苔藓外植体，该消毒方法操作简单、所需外植体量少、操作门槛低、不使用高污染消毒剂、对环境无害，试验效果好。适合在植物组织培养技术领域推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种苔藓植物外植体的消毒方法
本专利技术涉及植物组织培养
，尤其是一种苔藓植物外植体的消毒方法。
技术介绍
苔藓植物一般生长在较阴暗，较潮湿的土壤、林下、沼泽、岩石及树皮等阴面，通过配子体叶片等微孔吸收大气中的营养物质，同时由于苔藓一般为丛生，植株间紧密生长，因此外植体上附着大量微生物，且不易清除。并且由于苔藓植物外植体大多是单层细胞构成，细胞容易因为消毒过度而死亡，一些稀缺苔藓植物不容易获得孢蒴，苔藓生物量少，采集不易等，这些因素都极大地阻碍了苔藓组织培养的发展，以及对苔藓种质资源的保护和利用。外植体消毒是进行组织培养的第一步，现有的方法，多采用升汞进行消毒，浓度过高易造成外植体死亡，且容易残留，不易清洗消除，消毒效果不太理想，并且升汞是高毒性污染物，对人体伤害大，排出环境易造成土壤重金属残留。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种杀菌效果好、消毒废液不污染环境且对人体无害、毒性小、不易损伤苔藓植物的苔藓植物外植体的消毒方法。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：该苔藓植物外植体的消毒方法，包括以下步骤：A、苔藓植物外植体的选取：挑选健壮的、生长旺盛的外植体，将外植体的假根部分切除后，放入流水中冲洗时间为3-8min；B、将经过步骤A处理过后的外植体放入超声波震荡仪中清洗1-2h；C、将经过步骤B处理过后的外植体浸泡在浓度为500mg/l的氨苄青霉素钠溶液中，并且在避光条件下恒温浸泡1-2h，所述氨苄青霉素钠溶液的温度为3.5-4.5度；D、将经过步骤C处理过后的外植体依次经过如下浸泡处理：首先，放入浓度为75％酒精中浸泡一段时间后，利用无菌水清洗一段时间后接着放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为75％酒精中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡一段时间，最后再利用无菌水清洗干净备用；E、将经过步骤D处理过后的外植体放入培养皿中，培养皿底部装有无菌过滤棉，并在培养皿中加入营养液，加入的营养液量将培养皿底部放置的无菌过滤棉完全湿润即可，所述营养液由6-BA、氨苄青霉素钠、knop无机培养液组成，其中6-BA的浓度为0.1mg/L，氨苄青霉素钠的浓度为500mg/L；F、将培养皿置于培养箱中培养14-21天至培养基表面形成原丝体和茎叶体，培养箱的温度为23-25度；每天24d中在黑暗中培养的时间为6-10小时，其余时间为光照下培养；G、剪取培养基表面形成的原丝体和茎叶体，并依次经过如下浸泡处理：首先，放入浓度为75％酒精中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后接着放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为75％酒精中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡一段时间，最后再利用无菌水清洗干净后即可得到无菌的苔藓外植体。进一步的是，在步骤A中，将外植体的假根部分切除后放入流水中冲洗时间为5min。进一步的是，在步骤B中，将外植体放入超声波震荡仪中清洗2h，所述超声波震荡仪的超声波清洗频率为40kHz。进一步的是，在步骤C中，将外植体浸泡在浓度为500mg/l的氨苄青霉素钠溶液中，并且在避光条件下恒温浸泡1h，所述氨苄青霉素钠溶液的温度为4度。进一步的是，在步骤D中，将外植体依次经过如下浸泡处理：首先，放入浓度为75％酒精中浸泡5s，利用无菌水清洗5s后接着放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡10s，利用无菌水清洗5s后再放入浓度为75％酒精中浸泡5s，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡10s，最后再利用无菌水清洗干净备用。进一步的是，所述无菌过滤棉的形状与培养皿底部形状相同，所述无菌过滤棉的厚度为0.5cm。进一步的是，所述knop无机培养液的溶剂为水，溶质包括(Ca(NO3)2·4H2O、KNO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7(H2O)，所述Ca(NO3)2·4H2O的浓度为1g/L，KNO3的浓度为0.25g/L，KH2PO4的浓度为0.25g/L，MgSO4·7H2O的浓度为0.25g/L、ZnSO4·7H2O的浓度为0.003g/L，pH＝5.8。进一步的是，在步骤F中，将培养皿置于培养箱中培养15天，培养箱的温度为23-25度；每天24d中在黑暗中培养的时间为8小时，其余时间为光照下培养。进一步的是，在步骤G中，剪取培养基表面形成的原丝体和茎叶体，并依次经过如下浸泡处理：首先，放入浓度为75％酒精中浸泡5s，利用无菌水清洗5s后接着放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡10s，利用无菌水清洗5s后再放入浓度为75％酒精中浸泡5s，利用无菌水清洗5s后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡5s，最后再利用无菌水清洗干净后即可得到无菌的苔藓外植体。本专利技术的有益效果是：该苔藓植物外植体的消毒方法的通过挑选健壮的、生长旺盛的外植体，将外植体的假根部分切除后，放入流水中冲洗时间为3-8min；接着放入超声波震荡仪中清洗1-2h；然后将外植体浸泡在浓度为500mg/l的氨苄青霉素钠溶液中，并且在避光条件下恒温浸泡1-2，接着将外植体依次经过如下浸泡处理：首先，放入浓度为75％酒精中浸泡一段时间后，利用无菌水清洗一段时间后接着放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为75％酒精中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡一段时间，最后再利用无菌水清洗干净后放入培养皿中，培养皿底部装有无菌过滤棉，并在培养皿中加入营养液，加入的营养液量将培养皿底部放置的无菌过滤棉完全湿润即可，接着将培养皿置于培养箱中培养14-21天至培养基表面形成原丝体和茎叶体，剪取培养基表面形成的原丝体和茎叶体，并依次经过如下浸泡处理：首先，放入浓度为75％酒精中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后接着放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为75％酒精中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡一段时间，最后再利用无菌水清洗干净后即可得到无菌的苔藓外植体，本专利技术通过苔藓独特而极强的再生能力，通过低浓度，多循环的消毒手段及无碳源添加等多种措施，本专利技术所述苔藓植物外植体的消毒方法操作简单、所需外植体量少、操作门槛低、不使用高污染消毒剂、对环境无害，试验效果好，适合苔藓植物及其他脆弱植株体无菌材料的消毒获取。附图说明图1为利用本专利技术所述的苔藓植物外植体的消毒方法对原丝体消毒后获得的苔藓生长一个月后的生长情况图；图2为利用本专利技术所述的苔藓植物外植体的消毒方法对茎叶体消毒后获得的苔藓生长一个月后的生长情况图；图3为采用传统方法消毒后获得的苔藓生长一个月后的生长情况图。具体实施方式苔藓植物是植物中最简单最低等的高等植物，拥有独特的生态位和再生能力。在营养需求上，苔藓植物主要通过配子体的吸附作用吸收大气中的养分。作为自养型生物，苔藓可以在不添加碳源的简单无机离子培养基中生长，如knop培养基。在再生能力上，大部分苔藓植物和蕨类等孢子植物在其再生体系中通过原丝体为枢纽可进行互相转化。大部分苔藓植物在转化上本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种苔藓植物外植体的消毒方法，其特征在于包括以下步骤：A、苔藓植物外植体的选取：挑选健壮的、生长旺盛的外植体，将外植体的假根部分切除后，放入流水中冲洗时间为3‑8min；B、将经过步骤A处理过后的外植体放入超声波震荡仪中清洗1‑2h；C、将经过步骤B处理过后的外植体浸泡在浓度为500mg/l的氨苄青霉素钠溶液中，并且在避光条件下恒温浸泡1‑2h，所述氨苄青霉素钠溶液的温度为3.5‑4.5度；D、将经过步骤C处理过后的外植体依次经过如下浸泡处理：首先，放入浓度为75％酒精中浸泡一段时间后，利用无菌水清洗一段时间后接着放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为75％酒精中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡一段时间，最后再利用无菌水清洗干净备用；E、将经过步骤D处理过后的外植体放入培养皿中，培养皿底部装有无菌过滤棉，并在培养皿中加入营养液，加入的营养液量将培养皿底部放置的无菌过滤棉完全湿润即可，所述营养液由6‑BA、氨苄青霉素钠、knop无机培养液组成，其中6‑BA的浓度为0.1mg/L，氨苄青霉素钠的浓度为500mg/L；F、将培养皿置于培养箱中培养14‑21天至培养基表面形成原丝体和茎叶体，培养箱的温度为23‑25度；每天24d中在黑暗中培养的时间为6‑10小时，其余时间为光照下培养；G、剪取培养基表面形成的原丝体和茎叶体，并依次经过如下浸泡处理：首先，放入浓度为75％酒精中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后接着放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为75％酒精中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡一段时间，最后再利用无菌水清洗干净后即可得到无菌的苔藓外植体。...

【技术特征摘要】
1.一种苔藓植物外植体的消毒方法，其特征在于包括以下步骤：A、苔藓植物外植体的选取：挑选健壮的、生长旺盛的外植体，将外植体的假根部分切除后，放入流水中冲洗时间为3-8min；B、将经过步骤A处理过后的外植体放入超声波震荡仪中清洗1-2h；C、将经过步骤B处理过后的外植体浸泡在浓度为500mg/l的氨苄青霉素钠溶液中，并且在避光条件下恒温浸泡1-2h，所述氨苄青霉素钠溶液的温度为3.5-4.5度；D、将经过步骤C处理过后的外植体依次经过如下浸泡处理：首先，放入浓度为75％酒精中浸泡一段时间后，利用无菌水清洗一段时间后接着放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为75％酒精中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡一段时间，最后再利用无菌水清洗干净备用；E、将经过步骤D处理过后的外植体放入培养皿中，培养皿底部装有无菌过滤棉，并在培养皿中加入营养液，加入的营养液量将培养皿底部放置的无菌过滤棉完全湿润即可，所述营养液由6-BA、氨苄青霉素钠、knop无机培养液组成，其中6-BA的浓度为0.1mg/L，氨苄青霉素钠的浓度为500mg/L；F、将培养皿置于培养箱中培养14-21天至培养基表面形成原丝体和茎叶体，培养箱的温度为23-25度；每天24d中在黑暗中培养的时间为6-10小时，其余时间为光照下培养；G、剪取培养基表面形成的原丝体和茎叶体，并依次经过如下浸泡处理：首先，放入浓度为75％酒精中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后接着放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为75％酒精中浸泡一段时间，利用无菌水清洗一段时间后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡一段时间，最后再利用无菌水清洗干净后即可得到无菌的苔藓外植体。2.如权利要求1所述的苔藓植物外植体的消毒方法，其特征在于：在步骤A中，将外植体的假根部分切除后放入流水中冲洗时间为5min。3.如权利要求1所述的苔藓植物外植体的消毒方法，其特征在于：在步骤B中，将外植体放入超声波震荡仪中清洗2h...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈振华，陈仕勇，韦彦妃，
申请(专利权)人：西南民族大学，
类型：发明
国别省市：四川,51