本发明专利技术公开了一种检测Nebovirus的SYBR Green荧光定量RT‑PCR引物及应用，该引物的序列如SEQ ID NO:1～2所示。该引物可以应用于Nebovirus的快速诊断中，本发明专利技术可快速、特异、灵敏地检测Nebovirus，最低检测浓度为29copies/μL。本发明专利技术使用的操作方法简单、反应结果易于判断，灵敏性和检出率高，并且能够避免假阳性现象，适用于疾病监测、现场应急及临床样品的检测，适合大范围推广应用。
【技术实现步骤摘要】
一种检测Nebovirus的SYBRGreen荧光定量RT-PCR引物及应用
本专利技术属于病毒检测
，具体地说，涉及一种检测Nebovirus的SYBRGreen荧光定量RT-PCR引物及应用。
技术介绍
Nebovirus(NeV)是最近新发现的一种致犊牛腹泻的病原，与诺如病毒属(Norovirus)、扎幌病毒属(Sapovirus)、兔病毒属(Lagovirus)及水疱疹病毒(Vesivirus)同属杯状病毒科(Caliciviridae)。实验感染Nebovirus可在2至5天后引起肠道病变和腹泻，粪便颜色从浓稠的棕绿色糊状物到浅棕色糊状物最后到到黄色带有絮状碎屑液体状。临床症状表现为厌食，木糖吸收不良，嗜睡。Nebovirus首次在英国发现后，相继在美国、韩国、法国、日本、意大利、中东突尼斯、土耳其、巴西等11个国家均有报道。在2017年，该病毒被我国西南民族大学汤承课题组首次发现，并证明该病毒在我国广泛流行。目前对于Nebovirus尚无预防用生物制品，能准确、快捷、有效的检测Nebovirus(NeV)对于提高对该病毒的防控是至关重要的。根据本实验室前期研究数据表明，我国的Nebovirus毒株的常用的分子检测靶基因序列与国外毒株的序列差异大，具有独特的共进化特征。国外建立的检测方法在国内并不适用，因此其检测结果的准确性是有待考究的。由此可见，有必要对我国的Nebovirus建立分子检测方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种检测Nebovirus的SYBRGreen荧光定量RT-PCR引物及应用，本专利技术在多株Nebovirus基因序列比对基础上，基于RdRp基因的3’端设计了特异性引物，对Nebovirus进行快速、准确地鉴别，具有简单、快速、灵敏度高和特异强的特点。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种检测Nebovirus的SYBRGreen荧光定量RT-PCR引物，包括上游引物NeVF、下游引物NeVR，其中，上游引物NeVF的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，下游引物NeVR的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术还公开了一种检测Nebovirus的SYBRGreen荧光定量RT-PCR的方法，包括以下步骤：提取待检测样品的RNA，以待检测样品的RNA为模板，反转录得到cDNA，用上述的引物和SYBRGreen对cDNA进行荧光定量RT-PCR扩增；通过实时荧光定量PCR仪进行结果的读取，判断S型扩增曲线和荧光强度值，在扩增曲线正常的情况下，若荧光强度值超过阈值时，则记为阳性，则该待检测样品含有Nebovirus病毒，若荧光强度值低于阈值时，则记为阴性，则该待检测样品不含有Nebovirus病毒。可选地，所述反转录的步骤为：将RNA模板4μL、1号5×PrimeScriptBuffer4μL、2号PrimeScriptRTEnzymeMix1μL、4号Random6mers2μL和5号RNaseFreedH2O9μL混匀，放入PCR仪上进行反转录。可选地，所述反转录反应所需试剂为宝生物工程(大连)有限公司的PrimeScriptTMRT试剂。可选地，荧光定量PCR反应检测体系为：TBGreenPremixExTaqII10μL，上游引物NeVF、下游引物NeVR各1.0μL，cDNA模板100ng，用ddH2O补齐到20μL。可选地，所述的荧光定量RT-PCR反应条件为:95℃预变性2min；PCR:95℃反应15sec，51℃反应20sec进行40个循环。本专利技术还公开了一种上述的检测Nebovirus的SYBRGreen荧光定量RT-PCR引物在Nebovirus的快速诊断中的应用。与现有技术相比，本专利技术可以获得包括以下技术效果：1)本专利技术首次建立检测Nebovirs的分子检测方法：Nebovirus作为我国犊牛腹泻的新发病原，尚未建立该病毒的检测方法。本专利技术设计的引物是根据国内毒株公布的所有Nebovirus序列，能很好的对国内牛的现有毒株进行检测。2)本专利技术不仅操作步骤少，只需要常规的提取核酸，进行反转录后就能进行SYBRGreen荧光定量PCR检测；能节约大量时间，整个扩增只需要1h即可完成，检测的灵敏度到29copies/μL。3)本专利技术的阳性结果鉴定便捷，只需要判断其CT值是否大于“0”即可；比国外的分子检测方法灵敏性高，稳定性好，检出率高；比检测Nebovirus的核酸电泳方法更加快捷、准确，为Nebovirus的快速诊断和流行病学调查奠定了基础。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本专利技术的一部分，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1是本专利技术阳性模板经48℃-53℃7个退火温度PCR扩增后曲线图；其中，N代表阴性对照，1-7代表同一个实验样本；图2是本专利技术本专利技术引物特异性实验结果图；其中，1：NeV病毒样品；2：牛轮状病毒样品；3：牛冠状病毒样品；4：牛病毒性腹泻样品；5：牛诺如病毒样品；6：大肠杆菌样品；7：沙门氏菌样品；图3是本专利技术引物灵敏度实验的检测结果图，其中A:2.9×109拷贝/μL；B:2.9×108拷贝/μL；C:2.9×107拷贝/μL；D:2.9×106拷贝/μL；E:2.9×105拷贝/μL；F:2.9×104拷贝/μL；G:2.9×103拷贝/μL；H:2.9×102拷贝/μL；I:2.9×10拷贝/μL。具体实施方式以下将配合实施例来详细说明本专利技术的实施方式，借此对本专利技术如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。实施例1引物设计根据NCBI登陆的所有国内已经发表的24个NeV的毒株RdRp序列(MH718886–MH718908；MG599036.1)，应用Primer5.0软件设计针对NeV的RdRp的3’端基因的特异性引物，所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。上游引物NeVF：CAGCCCGTCTGGGTGAAT，SEQIDNO:1；下游引物NeVR：CTGGATRGTTCTGACTTCGG(其中R代表A或G)，SEQIDNO:2。实施例2检测Nebovirus的SYBRGreen荧光定量RT-PCR方法的建立：该方法包括以下步骤：(1)待检测样品RNA提取：待检粪便样品与PBS(1:5)充分重悬混匀，－80℃冰箱中反复冻融3次，3000r·min-1离心10min，弃沉淀，再以8000r·min-1离心5min，取上清。然后按照TrizolReagent说明书提取总RNA，备用。(2)提取的RNA加入到购自宝生物工程(大连)有限公司的反转录试剂盒进行反转录，得到cDNA模板：反转录步骤为：将RNA模板4μL、1号5×PrimeScriptBuffer4μL、2号PrimeScriptRTEnzymeMix1μL、4号Random6mers2μL和5号RNaseFreedH2O9μL混匀，放入PCR仪上进行反转录。其反应条件：37℃15min，85℃15s，16℃10min。此反转录试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。(3)SYBR本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测Nebovirus的SYBR Green荧光定量RT‑PCR引物，其特征在于，包括上游引物NeV F、下游引物NeV R，其中，上游引物NeV F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物NeV R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
【技术特征摘要】
1.一种检测Nebovirus的SYBRGreen荧光定量RT-PCR引物，其特征在于，包括上游引物NeVF、下游引物NeVR，其中，上游引物NeVF的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，下游引物NeVR的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。2.一种检测Nebovirus的SYBRGreen荧光定量RT-PCR的方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待检测样品的RNA，以待检测样品的RNA为模板，反转录得到cDNA，用权利要求1中所述的引物和SYBRGreen对cDNA进行荧光定量RT-PCR扩增；通过实时荧光定量PCR仪进行结果的读取，判断S型扩增曲线和荧光强度值，在扩增曲线正常的情况下，若荧光强度值超过阈值时，则记为阳性，则该待检测样品含有Nebovirus病毒，若荧光强度值低于阈值时，则记为阴性，则该待检测样品不含有Nebovirus病毒。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述反转录的步骤为：将RNA模板4μL、1号5×...
【专利技术属性】
技术研发人员：汤承，岳华，郭紫晶，王远微，
申请(专利权)人：西南民族大学，
类型：发明
国别省市：四川,51
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