Crp制造技术

本发明专利技术公开了Crp

【技术实现步骤摘要】
CrpM基因在提高葡糖杆菌属菌株的DHA胁迫耐受性中的应用
本专利技术涉及生物工程和基因工程
，具体涉及CrpM基因及CrpM操纵子在提高葡糖杆菌属菌株的DHA胁迫耐受性中的应用。
技术介绍
1,3-二羟基丙酮(1,3-Dihydroxyacetone，DHA)是最简单的酮糖，外观是白色粉末状结晶，有甜味，易溶于水、乙醇、丙酮和乙醚等溶剂，是一种重要的精细化工产品，可作为农药合成中间体、精细化工原料和医药前体，用途广泛且使用量大。二羟基丙酮的工业化生产主要是利用能够合成高活性甘油脱氢酶的微生物以甘油为底物发酵生产。目前报道最多的微生物为葡糖杆菌属(Gluconobacter)，如Gluconobacteroxydans、Gluconobacterfrateurii、Gluconobactermelanogenus等菌种，葡糖杆菌属生产性能稳定，甘油生成DHA的转化率高，DHA产量可以达到150g/L以上，是工业发酵上常用的菌株。在DHA发酵过程中，当产物DHA的积累到一定量时会抑制葡糖杆菌属菌株的生长，造成菌体生长停止。DHA产物的抑制作用属于反馈抑制，据报道，基于DHA反馈抑制动力学和死亡率动力学模型分析，当DHA浓度达到61g/L时菌体停止生长，当DHA浓度达到108g/L时甘油停止转化。当DHA浓度过高时葡糖杆菌属菌株细胞受到不可逆的损伤，DHA对磷酸戊糖循环也有抑制作用。产物的抑制作用限制了高生产强度发酵生产DHA，研究发现，解决底物和产物的抑制作用一般是优化发酵工艺，如通过复杂的半连续两阶段反复补料发酵、固定化细胞、静息细胞转化来消除产物的抑制效果。上述工艺虽然能在一定程度上消除产物的抑制效果，但是会增加设备投入，造成生产工艺冗长，增加发酵成本。通过对菌种的理性设计改造，提升DHA生产菌种对产物的耐受性，是解决DHA产物抑制效果的有效策略之一。由于DHA对葡糖杆菌属菌株的生长抑制机制复杂，目前尚未有解析该机制的报道。因此，通过理性改造葡糖杆菌属菌株提高其对DHA的耐受性存在技术障碍。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术中由于DHA对葡糖杆菌属菌株的生长抑制机制复杂，尚缺少提升DHA生产菌种对产物的耐受性的有效策略的缺陷，通过在葡糖杆菌属如：Gluconobacteroxydans、Gluconobacterfrateurii、Gluconobactermelanogenus等菌株中过量表达Crp突变体，能够显著提高葡糖杆菌属对1,3-二羟基丙酮的耐受性，显著增强1,3-二羟基丙酮的产量及生产强度。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了如下的技术方案：申请人发现G.frateuriiHD924环腺苷酸受体蛋白(cyclicampreceptorprotein)编码基因Crp的第211个碱基C突变为G，相应编码的第71个氨基酸Leu突变为Asp；第242个碱基A突变为C，相应编码的第81个氨基酸Leu突变为Asp后获得的突变体CrpM基因能够显著提高葡糖杆菌属对1,3-二羟基丙酮的耐受性，显著增强1,3-二羟基丙酮的产量及生产强度。Crp的基因如SEQIDNO：01所示，CrpM基因的序列如SEQIDNO：02所示。CrpM操纵子，该载体包含有CrpM基因。优选的，CrpM操纵子，其序列如SEQIDNO：03所示。基于SEQIDNO.3所示的核苷酸序列设计CrpF、CrpR引物，通过PCR扩增得到包含CrpM启动子、CDS序列、终止子的核苷酸序列。所述的CrpF、CrpR引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.4、SEQIDNO.5所示，CrpF为上游引物，在引物上引入EcoRI酶切位点；CrpF为下游引物，在引物上引入HindIII酶切位点。本专利技术所达到的有益效果是：通过CrpM基因对葡糖杆菌属菌种进行改造，可显著提升了DHA生产菌种对产物的耐受性，能够有效的提升甘油转化效率、增强DHA的生产强度、简化生产工艺、减少设备的投入、降低生产成本。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1是pKK-CrpM重组质粒物理图谱。具体实施方式以下结合附图对本专利技术的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例本实施例中用到的G.frateuriiHD924为本实验自主筛选菌株，即专利号201110388519.8的专利技术专利中提到的HD924，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCCNo.5397，保藏日期2011年10月28日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。G.oxydansCGMCC1.46购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，G.melanogenusIFO3293购自美国模式菌种收集中心。HPLC法测定DHA，测定方法：取发酵液1mL，12000r/min离心10min，取上清液0.5mL用蒸馏水稀释到测定线性范围(0～10g/L)，膜滤，然后进HPLC测定。外标法计算发酵液中DHA含量。色谱分离条件为:AminexHPX-87H色谱柱(300mm×7.8mm，9μm)，UV检测器检测波长为260nm，流动相：8mmol/L硫酸。柱温为50℃，流速为0.5mL/min，进样量30μL。甘油检测方法：采用HPLC法测定甘油含量。测定条件同DHA，检测器为RI检测器。菌体量测定方法：采用比浊法，菌液用2％稀盐酸稀释10倍后在560nm处测定吸光值。所用的培养基：FMD培养基(g/L)：甘油80，酵母浸粉15，KH2PO45，pH6.0，1×105Pa条件下灭菌15min)。一级种子培养基(g/L)：甘油50，酵母浸粉15，KH2PO43，琼脂粉20，pH6.0；二级种子培养基(g/L)：甘油30，酵母浸粉10，KH2PO43，琼脂粉20，pH6.0；摇瓶发酵培养基(g/L)：甘油160，酵母浸粉15，CaCO315，pH6.0；培养基中根据需要添加氨苄青霉素(100μg/mL)。限制性内切酶EcoRI、HindIII、T4连接酶均购自赛默飞公司；DNA聚合酶，细菌基因组提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒购自宝赛生物(杭州)公司。本专利技术将G.frateuriiHD924菌种接种到一级种子培养基，28℃、200r/min培养至对数期(OD560＝1.5)，取1mL种子培养液4000r/min离心5分钟，倒掉上清培养基，用无菌生理盐水对收集到的菌体重悬、4000r/min离心5分钟清洗三次，加入1mL10％甘油重悬。取15μL上述处理好的菌悬液，涂布已经灭菌的载片上，采用常压室温等离子体(ARTP)诱变仪进行诱变处理。ARTP诱变仪器功率设置为100W，使载片与射流出口的距离设置为4mm，气体流量为10L/min，照射时间分别为90s。将上述经过ARTP照射过的带有菌体的载片迅速放入装有1mL的生理盐水中，涡旋振荡1min，取已经振荡的菌液稀释涂平板，放入28℃恒温培养箱中培养2d。固体平板培养基成分(g/L)：甘油50，DHA150，酵母浸粉15，KH2PO43，琼脂粉20，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.CrpM基因在提高葡糖杆菌属菌株的DHA胁迫耐受性中的应用，其特征在于，所述的CrpM基因的序列如SEQ ID NO：02所示。

【技术特征摘要】
1.CrpM基因在提高葡糖杆菌属菌株的DHA胁迫耐受性中的应用，其特征在于，所述的CrpM基因的序列如SEQIDNO：02所示。2.一种CrpM操纵子，其特征在于，该载体包含有CrpM...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘宇鹏，李华，肖延铭，杨生玉，杨卫华，
申请(专利权)人：河南大学，
类型：发明
国别省市：河南,41