一种半滑舌鳎抗细菌病相关基因及其应用方法技术

本发明专利技术提供一种从半滑舌鳎中筛选的抗细菌病相关基因，该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1,编码的蛋白的序列为SEQ ID NO:2。本发明专利技术提供的基因与半滑舌鳎抗细菌病相关，其在肠中的表达量与鱼体抗病能力相关，表达水平越高，鱼体抗病能力越强；其体外重组表达的蛋白能够明显抑制几种革兰氏阴性菌的增殖，因此，在半滑舌鳎抗病家系选育、病害防治、饲料添加剂及杀菌剂研制等方面有应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种半滑舌鳎抗细菌病相关基因及其应用方法
本专利技术属于水产遗传育种
，具体涉及一种半滑舌鳎抗细菌病相关基因及其应用方法。
技术介绍
半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)主要分布在我国沿海地区，是我国重要的海水经济养殖鱼类，其肉质鲜美、营养丰富，深受广大消费者喜爱，具有良好的市场需求和养殖开发潜力。然而，高密度集约化的养殖模式以及环境污染等原因，致使半滑舌鳎腹水、烂鳍、烂尾等细菌性疾病频繁爆发，尤其是哈维氏弧菌所引起的皮肤等溃烂最为严重，造成了巨大的经济损失，严重阻碍了半滑舌鳎养殖业的发展。目前，对于鱼类哈维氏弧菌病的防治，主要依赖于抗生素，但药物的滥用不仅会产生药物残留、耐药性和环境污染等问题，对人体健康也存在潜在威胁。近年来，人们一直迫切地寻找能够代替传统抗生素的药物，并且随着越来越多的抗生素耐药菌株的出现，使得抗菌蛋白在水产养殖业、医药行业和食品添加剂等领域受到广泛的重视。抗菌蛋白是由基因编码的具有抗菌活性的生物大分子，是生命防御系统的重要组成部分。它的主要作用是抵御病原微生物的入侵，提高生物体自身的抗病性，维护生命活动的延续和正常运行。抗菌蛋白不仅对革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌有抵御作用，还能抑制或杀灭真菌、霉菌和病毒等。人们已从微生物、植物、动物和人体中分离纯化到多种抗菌蛋白以及利用基因工程重组技术合成了一些抗菌肽，不同来源的抗菌蛋白在水产养殖领域变得越来越重要。研究表明，在斑节对虾的养殖饲料中添加抗菌肽Mytilin可以显著提高其抗病毒感染能力；在饲料中添加抗菌肽可以显著提高凡纳滨对虾和南美白对虾的抗病能力；重组抗菌肽Chelonianin可以有效地控制感染哈氏弧菌罗非鱼的炎症发生并能提高其成活率。抗菌蛋白的研究在最近几年进展较快，随着蛋白质研究技术的日益成熟，抗菌蛋白质已成为抗病新基因开发的一个有效途径。目前已有一些关于半滑舌鳎免疫相关基因的研究报道，主要是通过同源克隆方法获得哺乳动物中报道过的免疫相关基因的同源基因。如干扰素、凝集素、组织相容性复合物家族、细胞因子家族、补体因子、肿瘤坏死因子、趋化因子、溶菌酶、转录因子、肌动蛋白激活蛋白(dctn5)、信号转导和转录激活激活子(stat5)、R-spondins分泌泛白等。然而，由于种族特异性的存在，这些同源基因编码的蛋白在半滑舌鳎等鱼类不一定具有抗病免疫的功能，特别是不一定具有抵抗半滑舌鳎特定病原菌的作用。另外，上述免疫相关基因在半滑舌鳎抗病家系和易感家系的表达水平和差异尚未见报道，很难将其开发为半滑舌鳎抗细菌病能力的标志性基因。所以，要筛选半滑舌鳎自身的抗特定病原菌的相关基因，最好是从半滑舌鳎自身进行筛选。鉴于此，结合半滑舌鳎抗病家系和不抗病家系的全基因组重测序数据和免疫组织转录组数据，利用全基因组关联分析(GWAS)等生物信息学技术，筛选新的组织特异性表达、具有抗细菌病相关功能和抗病家系优势表达的基因就显得非常重要。进一步对此类半滑舌鳎抗细菌病相关基因的功能及其在抗病免疫中的作用机制进行研究，探索其在半滑舌鳎抗病育种和病害防控中应用的技术途径等迫在眉睫，可以为半滑舌鳎抗病育种和病害防控提供理论基础和基因标记或基因产物。这对于半滑舌鳎等鱼类抗病育种及病害防控具有重要意义和应用价值。
技术实现思路
本专利技术首次提供了一种半滑舌鳎抗细菌病相关基因及其作为抗病力评价标记的应用，制备重组蛋白并鉴定重组表达产物的抑菌活性。为半滑舌鳎抗病良种选育提供基因序列和基因标记，并为绿色饲料添加剂以及抗菌剂的研发提供技术方法。本专利技术提供一种从半滑舌鳎中筛选的抗细菌病基因，该基因编码蛋白的序列为SEQIDNO:2；所述的基因，其一种具体的核苷酸序列为SEQIDNO:1；本专利技术所提供的基因适用做半滑舌鳎抗细菌病家系筛选的标记基因。本专利技术还提供上述抗细菌病相关基因在半滑舌鳎抗病力检测中的应用；本专利技术提供了一种检测上述抗细菌病相关基因的方法，是检测该基因在半滑舌鳎肠中表达的量；其表达量越高，抗细菌病能力越强。所述的方法使用的检测引物，其一种序列信息如下：上游引物：5’-GACCAACTGCCACCATACTCC-3’(SEQIDNO:3)下游引物：5’-TCGTCCTCCAAGCCAAACC-3’(SEQIDNO:4)；本专利技术提供了用于重组表达上述蛋白的重组表达菌株；本专利技术的蛋白用于制备半滑舌鳎哈维氏弧菌病防治的制品；本专利技术的蛋白还用于制备饲料添加剂和抗菌剂。本专利技术提供的基因与免疫抗病相关，其体外重组表达的蛋白能够明显抑制革兰氏阴性菌的增殖，因此，在半滑舌鳎病害防治、饲料添加剂及杀菌剂等方面有应用价值。附图说明图1：半滑舌鳎抗细菌病相关基因的cDNA全长序列和开放阅读框编码的氨基酸序列:SEQIDNO:1:半滑舌鳎抗细菌病相关cDNA全长序列。SEQIDNO:2:半滑舌鳎抗细菌病相关开放阅读框编码的氨基酸序列。图2：抗细菌病相关基因在半滑舌鳎健康成鱼各个组织中的表达水平：其中，2-1:RT-PCR半定量检测抗细菌病相关基因在半滑舌鳎健康成鱼各个组织中的表达水平。其中组织的英文缩写：L:肝脏；Sp:脾脏；K:肾脏；I:肠；Gi:鳃；H:心脏；Br：脑；St:胃；Bl:血液；Hk:头肾。2-2：qRT-PCR定量检测基因在半滑舌鳎健康成鱼各个组织中的表达水平。其中横坐标表示半滑舌鳎不同的组织，纵坐标表示基因在不同组织中的表达量，其中各组织的英文缩写同图2-1。图3：半滑舌鳎抗细菌病相关基因在哈维氏弧菌感染后免疫相关组织中的表达分析。横坐标表示感染后不同时间点，纵坐标表示抗细菌病相关基因在不同组织中的表达量。共检测了6个组织，包括：肠(Intestine)，鳃(Gill)，皮肤(Skin)，肾脏(Kidney)，肝脏(Liver)，脾脏(Spleen)。图4：半滑舌鳎抗细菌病相关基因的重组蛋白的诱导表达、分离纯化及鉴定：(A)重组蛋白诱导表达，M：蛋白marker，1：对照组未诱导表达，2：对照组诱导表达，3：重组蛋白组未诱导表达，4：重组蛋白组诱导表达；(B)重组蛋白可溶性分析及纯化，M:大分子量蛋白marker，1:超声波破碎后上清，2:超声波破碎后沉淀；(C)重组蛋白纯化和透析后，M:大分子量marker，1:纯化和透析后重组蛋白。图5：重组蛋白体外抑菌活性分析图：(1)抗细菌病相关基因的重组蛋白抑制哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)效果示意图，0为PBS作为阴性对照组；1为10mg/L的氨苄青霉素作为阳性对照组；2、3、4为3个不同浓度的重组蛋白作为实验组：其中2为0.6mg/ml，3为0.12mg/ml，4为0.054mg/ml。(2)抗细菌病相关基因的重组蛋白抑制副溶血性弧菌(VibrioParahemolyticus)效果示意图，0为PBS作为阴性对照组；1为10mg/L的氨苄青霉素作为阳性对照组；2、3、4为3个不同浓度的重组蛋白作为实验组：其中2为0.6mg/ml，3为0.12mg/ml，4为0.054mg/ml。(3)抗细菌病相关基因的重组蛋白抑制爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)效果示意图，0为PBS作为阴性对照组；1为10mg/L的氨苄青霉素作为阳性对照组；2、3、4为3个不同浓度的重组蛋白作为实验本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从半滑舌鳎中筛选的抗细菌病相关基因，其特征在于，所述的基因编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

【技术特征摘要】
1.一种从半滑舌鳎中筛选的抗细菌病相关基因，其特征在于，所述的基因编码蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:2。2.如权利要求1所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQIDNO:1。3.权利要求1所述基因作为半滑舌鳎抗细菌病家系筛选的标记基因的应用。4.权利要求1所述的基因在半滑舌鳎抗病力检测中的应用。5.一种检测权利要求1所述的基因表达量的方法，其特征在于，所述的方法是检测基因在半滑舌鳎肠中表达的量，表达水平越高，其抗病能力越强。6...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈松林，扶晓琴，陈亚东，周茜，王磊，李仰真，李明，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37