一种苏氨酸脱水酶及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，特别涉及一种苏氨酸脱水酶及其应用。由海洋假单胞菌Pseudomonas stutzeri 273中获得编码基因序列如SEQ ID NO.1中所示。所述苏氨酸脱水酶具有在体外催化半胱氨酸生成硫化氢的能力，同时苏氨酸脱水酶还具有以单酶体系催化半胱氨酸和氯化镉生成硫化镉纳米粒子的能力。利用本发明专利技术获得的纳米粒子具有较好的水溶性以及较高的荧光强度和荧光稳定性，可作为新型荧光探针应用于光电、生物传感器和生物医学等领域。

【技术实现步骤摘要】
一种苏氨酸脱水酶及其应用
本专利技术属于生物
，特别涉及一种苏氨酸脱水酶及其应用。
技术介绍
纳米结构粒子在电学、光学、磁性和力学等方面表现出优异的特性。其中金属硫化物纳米粒子由于在电子、光学、光电设备以及生物医疗方面的应用潜力，近年来受到广泛关注[1]。现有的金属硫化物纳米粒子制备方法多为化学法和物理法，如液相化学反应、水热生长法、高压处理法、物理气相沉积法、化学气相沉积法等[2]。现行方法存在能耗大、环境损害大、操作复杂等缺陷，利用生物合成法制备金属硫化物纳米粒子具有能耗小、环境友好、操作简便等优点。先前报道中引入生物因素的制备方法多限于在以Na2S等为前体的合成过程中利用生物分子控制纳米粒子的结构[3-6]，操作较为复杂，且对纳米粒子大小的控制能力较弱。参考文献：[1]黄雪琼,孔龙,黄寿强,etal.金属硫化物纳米吸附剂[J].化学进展,2017,29(01):83-92.[2]LaiCH,LuMYandChenLJ.Metalsulfidenanostructures:synthesis,propertiesandapplicationsinenergyconversionandstorage[J].JournalOfMaterialsChemistry,2012,22(1):19-30.[3]MaoCB,FlynnCE,HayhurstA,etal.Viralassemblyoforientedquantumdotnanowires[J].ProceedingsOftheNationalAcademyOfSciencesOftheUnitedStatesOfAmerica,2003,100(12):6946-6951.[4]FlynnCE,MaoCB,HayhurstA,etal.SynthesisandorganizationofnanoscaleII-VIsemiconductormaterialsusingevolvedpeptidespecificityandviralcapsidassembly[J].JournalOfMaterialsChemistry,2003,13(10):2414-2421.[5]ZhouZY,BedwellGJ,LiR,etal.Formationmechanismofchalcogenidenanocrystalsconfinedinsidegeneticallyengineeredvirus-likeparticles[J].ScientificReports,2014,4:6.[6]DunleavyR,LuL,KielyCJ,etal.Single-enzymebiomineralizationofcadmiumsulfidenanocrystalswithcontrolledopticalproperties[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofScience,2016,113(19):5275.
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种苏氨酸脱水酶及其在硫化镉纳米粒子制备中的应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种苏氨酸脱水酶，由海洋假单胞菌Pseudomonasstutzeri273中获得编码基因序列如SEQIDNO.1中所示。所述苏氨酸脱水酶氨基酸序列为SEQIDNO.2。所述苏氨酸脱水酶通过PCR扩增其DNA序列，而后酶切后转入大肠杆菌EscherichiacoliBL21中过量表达并利用HisTraphigh-performance(HP)柱分离纯化得到，即获得。所述获得PCR产物后用双酶切连接的方法将PCR产物与表达质粒pET28a连接，随后转化至大肠杆菌E.coliBL21中进行过量表达；表达过后，将大肠杆菌E.coliBL21在4℃、8000rmp离心20min并重悬于裂解缓冲液中利用超声破碎法裂解细胞，裂解后经滤膜过滤除菌，随后用进行重组苏氨酸脱水酶的分离纯化；其中，悬于裂解缓冲液为Tris50mmol/L、NaCl150mmol/L、10％甘油、pH8.0。所述分离纯化为用3-5倍体积的去离子水清洗HisTraphigh-performance(HP)柱，再用5倍体积的平衡缓冲液平衡柱子,将蛋白结合至柱子上，随后用咪唑缓冲液进行梯度洗脱，洗脱后收集组分于Tris缓冲液中过夜透析，随后分装储存于-80℃中以待利用；其中，平衡缓冲液为Tris50mmol/L、NaCl150mmol/L、10甘油、pH8.0；咪唑缓冲液为Tris50mmol/L、NaCl150mmol/L、咪唑50-250mmol/L、10％甘油、pH8.0；Tris缓冲液为Tris50mmol/L、NaCl150mmol/L、10％甘油、pH7.5。一种苏氨酸脱水酶的应用，所述苏氨酸脱水酶在制备纳米粒子中的应用。所述纳米粒子在作为荧光探针中的应用。所述纳米粒子为苏氨酸脱水酶在以含硫化合物作为包被物质以及金属盐和半胱氨酸作为底物，制备金属硫化物纳米粒子。所述含硫化合物为半胱氨酸、谷胱甘肽或植物螯合肽；金属盐为镉、锌、铜、碲、钼、铁、钴或镍的无机水溶性金属盐。一种利用单酶制备纳米粒子的制备方法，(1)将作为包被物的含硫化合物及作为底物的金属盐和半胱氨酸加入到含有权利要求1所述的苏氨酸脱水酶的Tris缓冲液中构建酶促体系；(2)将酶促体系至于37℃反应20-200min即可获得金属硫化物纳米粒子溶液。其中，制备过程中酶存在即可实现制备纳米颗粒，但酶用量越高，反应速度越快；进一步说，(1)将镉源和半胱氨酸加入到含有苏氨酸脱水酶的Tris缓冲液中构建酶促体系。(2)将酶促体系至于37℃反应20-200min即可获得硫化镉纳米粒子溶液。(3)所述步骤(1)中的镉源为氯化镉(CdCl2)溶液。(4)所述步骤(1)中的Tris缓冲液为Tris50mmol/L、NaCl150mmol/L、pH7.5。一种纳米粒子，按照所述制备方法获得的纳米粒子。本专利技术所利用的酶是海洋假单胞菌P.stutzeri273中的苏氨酸脱水酶，其通过大肠杆菌E.coliBL21过量表达并利用HisTraphigh-performance(HP)柱分离纯化得到。本专利技术所具有的优点：本专利技术苏氨酸脱水酶由海洋假单胞菌P.stutzeri273中获取得到，其具有较强的酶促能力和稳定的活性。本专利技术利用可在体外催化半胱氨酸产生H2S的重组酶苏氨酸脱水酶催化制备硫化镉纳米粒子，制备过程中原料简单易得，反应迅速，操作简便、能耗低、环境友好等优异的特点。制得的硫化镉纳米粒子具有较好的水溶性以及较高的荧光强度和荧光稳定性，可作为新型荧光探针应用于光电、生物传感器和生物医学等领域。附图说明图1A为本专利技术实施例提供的分离纯化的苏氨酸脱水酶的Native-PAGE电泳及氯化铋染色结果图；其中，棕色条带说明分离纯化的苏氨酸脱水酶具有代谢半胱氨酸产生H2S的活性。图1B为本专利技术实施例提供的分离纯化的苏氨酸脱水酶SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色结果图。图2A为本专利技术实施例提供的硫化镉纳米粒子溶液的紫外-可见光吸收光谱图。图2B为本专利技术实施例提供的硫化镉纳米粒子溶液的荧光光谱图。图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种苏氨酸脱水酶，其特征在于：由海洋假单胞菌Pseudomonas stutzeri 273中获得编码基因序列如SEQ ID NO.1中所示。

【技术特征摘要】
1.一种苏氨酸脱水酶，其特征在于：由海洋假单胞菌Pseudomonasstutzeri273中获得编码基因序列如SEQIDNO.1中所示。2.按权利要求1所述的苏氨酸脱水酶，其特征在于：所述苏氨酸脱水酶氨基酸序列为SEQIDNO.2。3.按权利要求1或2所述的苏氨酸脱水酶，其特征在于：所述苏氨酸脱水酶通过PCR扩增其DNA序列，而后酶切后转入大肠杆菌EscherichiacoliBL21中过量表达并利用HisTraphigh-performance(HP)柱分离纯化得到，即获得。4.按权利要求3所述的苏氨酸脱水酶，其特征在于：所述获得PCR产物后用双酶切连接的方法将PCR产物与表达质粒pET28a连接，随后转化至大肠杆菌E.coliBL21中进行过量表达；表达过后，将大肠杆菌E.coliBL21在4℃、8000rmp离心20min并重悬于裂解缓冲液中利用超声破碎法裂解细胞，裂解后经滤膜过滤除菌，随后进行重组苏氨酸脱水酶的分离纯化；其中，悬于裂解缓冲液为Tris50mmol/L、NaCl150mmol/L、10％甘油、pH8.0。5.按权利要求4所述的苏氨酸脱水酶，其特征在于：所述分离纯化为用3-5倍体积的去离子水清洗HisTraphigh-performance(HP)柱，再用5倍体积的平衡缓冲液平衡柱子,将蛋白结合至柱子上，随后用咪唑缓冲液进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙超岷，马宁，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37