一种分泌抗AGR2的单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种针对AGR2的单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，所述杂交瘤细胞株的分类命名为：小鼠杂交瘤细胞株，该细胞株于2018年08月28日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。保藏中心登记入册保藏编号为CGMCC No.16288。由所述杂交瘤细胞株分泌得到的单克隆抗体能够有效检测结肠癌细胞如HT29细胞及结肠癌组织中的AGR2，特异性好。此外还可阻断AGR2促进结肠癌的转移，具体为体外实验抑制结肠癌细胞的迁移。

【技术实现步骤摘要】
一种分泌抗AGR2的单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
本专利技术属于单克隆抗体领域，涉及一种稳定表达可特异性针对AGR2(前梯度蛋白2)的单克隆抗体的细胞株以及该细胞株和产生的单克隆抗体的应用。
技术介绍
AGR2是非洲爪蟾（Xenopus）前梯度蛋白-2（XAG-2）在人类中的同源蛋白。在人体中AGR2蛋白主要与腺体的分泌功能有关，因此在富含粘液或者具有分泌功能的一些组织器官中高表达，如结直肠、胃、乳腺和前列腺等。AGR2蛋白属于PDI家族（蛋白质二硫键异构酶）中的一员，主要定位于内质网上，同时也能够被分泌到细胞外。在血清、尿液等体液标本中均能检测到分泌型AGR2蛋白的存在。人们最早发现AGR2与肿瘤相关是在乳腺癌中，随着研究的不断深入，人们发现AGR2作为一个促癌分子与多种肿瘤的发生发展都有密切联系，AGR2在肿瘤中的作用越来越受到人们的重视。在前期研究中专利技术人发现外源性AGR2能够促进结直肠癌细胞的迁移，其表达量与肿瘤预后密切相关。此外有研究发现AGR2可以与细胞外基质相互作用促进肿瘤发生发展。因此AGR2可能成为一个潜在的肿瘤治疗靶点。因此有必要开发用于检测、靶向AGR2的单克隆抗体，为癌症的诊断、治疗提供新的思路和工具，具有重要的意义及应用价值。本专利采用带有his标签的AGR2全长蛋白免疫ICR小鼠，因为免疫蛋白所携带的标签分子量较小，相对于MBP、GST等大分子标签来说免疫原性较低，产生的抗体特异性较好。此外采用的ICR小鼠相关融合稳定性高，排异性小，后期产生的抗体稳定性较好。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种分泌抗AGR2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。所述杂交瘤细胞株的分类命名为：小鼠杂交瘤细胞株，该细胞株于2018年08月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：中国北京。保藏中心登记入册编号为CGMCCNo.16288。本专利技术目的之二在于提供了一种能特异性地识别、靶向AGR2蛋白的单克隆抗体10G11。该抗体由上述杂交瘤细胞株分泌。本专利技术目的之三在于提供了上述的针对AGR2杂交瘤细胞或单克隆抗体的应用。上述杂交瘤细胞株在制备AGR2蛋白检测或诊断相关药物及试剂中的应用；上述杂交瘤细胞株在制备治疗癌症的药物及制剂中的应用；上述单克隆抗体在制备AGR2蛋白检测或诊断相关药物及试剂中的应用；上述单克隆抗体在制备治疗癌症的药物及制剂中的应用。本专利技术提供了一种制备AGR2单克隆抗体的方法，主要包括以下步骤：1）重组表达载体的构建根据AGR2开放阅读框序列，设计引物扩增AGR2编码区，通过EcoRI和XhoI酶切位点插入到pET28a载体中，构建pET28a-AGR2-His重组表达载体。）AGR2重组蛋白的表达和纯化将步骤1）中构建好的重组表达载体转化至BL21感受态细菌中，IPTG诱导蛋白表达，超声裂解细菌，离心获得蛋白上清。通过镍柱亲和层析柱纯化，获得纯化的AGR2蛋白。）单克隆抗体的筛选与制备将步骤2)中纯化的AGR2蛋白免疫ICR雌鼠，经过初次免疫和加强免疫后，取小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0融合，有限稀释法获得单克隆。通过ELISA方法筛选出阳性杂交瘤细胞株，得到能够分泌针对AGR2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为10G11，亚型鉴定为IgG1型。将杂交瘤细胞株接种至小鼠腹腔，收集小鼠腹水，通过ProteinA/G纯化抗体。本专利技术的优点在于：专利技术人通过上述方法制备得到的抗体能够有效检测结肠癌细胞如HT29及结肠癌组织中的AGR2，特异性好。此外还可阻断AGR2促进结肠癌的转移，具体为体外实验抑制结肠癌细胞的迁移。所述的结肠癌细胞包括SW48及HT29，体外转移实验采用本领域常见的实验方法确定，如附图2中的肿瘤迁移小室实验（Transwell实验）。附图说明图1显示pET28a-AGR2-C-His质粒克隆位点的设计图，其中阴影部分为AGR2的编码区；图2显示AGR2蛋白在菌液上清及沉淀中的表达结果；图3显示AGR2蛋白表达及纯化结果；图4显示WesternBlot实验筛选小鼠血清中AGR2抗体特异性识别AGR2蛋白的结果；图5显示Transwell实验筛选小鼠血清中AGR2抗体阻断结肠癌细胞迁移的结果；图6显示WesternBlot实验筛选单克隆细胞株细胞上清中AGR2抗体特异性识别结肠癌细胞中内源性AGR2蛋白的结果；图7显示Transwell实验筛克隆细胞株细胞上清中AGR2抗体阻断结肠癌细胞迁移的结果；图8显示纯化的AGR2抗体纯度检测结果；图9显示Transwell实验验证AGR2单克隆抗体可以阻断外源性AGR2蛋白促进SW48细胞的迁移；图10显示Transwell实验检测AGR2单克隆抗体可以阻断分泌型AGR2促进HT29细胞的迁移；图11显示WesternBlot实验检测AGR2单克隆抗体特异性识别结肠癌细胞中内源性AGR2蛋白的结果；图12显示免疫荧光实验检测AGR2单克隆抗体特异性识别结肠癌细胞中内源性AGR2蛋白的结果。具体实施方式按照说明书说描述的具体实施方案，本领域技术人员能够按照其描述再现其实施例并能制备其所述产物。说明书中的所有术语均采用本领域公知的专业术语（包括原料等的英文缩写），无法采用专业术语的，说明书会对所用术语进行解释及说明，使得本领域技术人员清楚其含义。除非特殊说明，说明书中所采用的技术手段均是本领域的常规技术，在已发表文献中均可查阅。实施例1AGR2重组表达质粒的构建从NCBI网站获得AGR2开放阅读框（ORF）核苷酸序列。以人的基因组cDNA为模板，分别以AGR2-F、AGR2-R为引物扩增AGR2全长，回收目的片段，与酶切后的pET28a载体进行融合重组。载体的克隆位点设计图如图1所示，通过酶切位点EcoRI和XhoI，将AGR2基因编码区插入到pET28a载体中，构建ET28a-AGR2-His重组表达载体。步骤1）目的基因引物设计设计合成以下引物，用于扩增AGR2开放阅读框全长：AGR2-F：ATGGGTCGCGGATCCGAATTCATGGAGAAAATTCCAGTGTC；AGR2-R：GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAATTCAGTCTTCAGCAACT。步骤2）目的基因扩增以人基因组cDNA为模板，分别以AGR2-F、AGR2-R为引物扩增AGR2全长，扩增体系如下：扩增条件如下：95℃预变性3min；95℃变性15s、56℃退火15s、72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃再延伸5min；步骤3）酶切载体用EcoRI和XhoI双酶切pET28a载体，37℃酶切1小时。酶切体系如下：步骤4）载体与目的基因连接将酶切后载体进行胶回收后与扩增的目的基因进行融合重组，37℃反应30分钟。重组体系如下：步骤5）质粒鉴定将上述步骤中连接产物转化至DH5α感受态细菌：从-80℃冰箱取50ul感受态细菌，冰上融化后，加入上述连接产物，冰置20min后，42℃水浴热激90s，继续冰置10min后加入1ml无抗性LB培养基，在37度摇床孵育45min后5000rpm离心3min收集适量菌液，涂布于含有卡那霉素抗生素的LB平板中，将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养；挑取单克隆本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分泌抗AGR2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的分类命名为：小鼠杂交瘤细胞株，该细胞株于2018年08月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册保藏编号为CGMCC No.16288。

【技术特征摘要】
1.一种分泌抗AGR2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的分类命名为：小鼠杂交瘤细胞株，该细胞株于2018年08月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册保藏编号为CGMCCNo.16288。2.一种能特异性地识别、靶向AGR2蛋白的单克隆抗体，其特征在于：命名为单克隆抗体10G11，由权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌得到。3.权利要求1所述杂交瘤细胞株在制备AGR2蛋白检测或诊断的药物或试剂中的应用。4.权利要求1所述杂交瘤细胞株在制备治疗癌症的药物或试剂中的应用。5.权利要求2所述单克隆抗体在制备AGR2蛋白检测或诊断的药物或试剂中的应用。6.权利要求2所述单克隆抗体在制备治疗癌症的药物或试剂中的应用。7.权利要求2所述单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：1）重组表达载体的构建根...

【专利技术属性】
技术研发人员：王征，王琳，胡嘉，储亚楠，田少博，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：湖北,42