片段缩合制备地加瑞克的方法技术

本发明专利技术公开了一种片段缩合制备地加瑞克的方法，分别合成3个侧链保护的肽片段序列，将各肽片段逐步偶联得到全保护地加瑞克，然后裂解脱除保护基得到地加瑞克粗肽，纯化换盐得到地加瑞克；其中，所述的3个肽片段序列为：第一肽片段序列为地加瑞克序列中的第1‑4位氨基酸，第二肽片段序列为地加瑞克序列中的第5‑8位氨基酸，第三肽片段序列为地加瑞克序列中的第9‑10位氨基酸。本发明专利技术方法，减少了杂质，提高了产率，大幅降低了合成成本，有利于大规模、产业化生产。

【技术实现步骤摘要】
片段缩合制备地加瑞克的方法
本专利技术涉及制药领域，具体涉及片段缩合制备地加瑞克的方法。
技术介绍
地加瑞克，英文名：Degarelix，是一个十肽，其中含有七个非天然氨基酸，序列为：Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-AIa-NH2。地加瑞克是第三代促性腺激素释放激素(GnRH)受体拮抗剂，用于治疗前列腺癌，可迅速起效，抑制促性腺素、睾酮和前列腺特异性抗原。地加瑞克的合成方法如专利US5925730，优选的α-氨基保护基是叔丁氧羰基(Boc)，Boc基团在酸性条件下通过三氟乙酸(TFA)的标准处理脱除。缺点在于，TFA毒性高，对环境有污染，后处理成本高；而且高比例的TFA会造成肽从树脂上脱落，反复使用TFA使该效果叠加，损失增加，收率降低。同时肽树脂需要HF裂解，HF剧毒，有强腐蚀性，对人和环境有较大的危害，对于大规模工业生产来说，有较大的安全隐患。所以产业化生产更多使用的是芴甲氧羰基(Fmoc)来进行α-氨基保护。地加瑞克中5位氨基酸Aph(Hor)。在碱性条件下，包含二氢尿嘧啶部分的化合物会发生重排而成为包含乙内酰脲部分的化合物。所以在地加瑞克的合成过程中，中间体Fmoc-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH-树脂在碱性条件下脱保护的过程中发生部分重排而成为Fmoc-X-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH-树脂，X为4-([2-(5-乙内酰脲基)]-乙酰基氨基)-苯丙氨酸。因此，在采用保护基Fmoc的药物级地加瑞克的制造工艺中，应当尽量避免碱性条件。专利CN102428097采用Fmoc策略固相法依次连接合成地加瑞克，该方法使用哌啶脱除Fmoc，但是反复脱保护过程接触碱性条件，只能降低该杂质的出现(0.1-0.3％)，并不能解决该问题。专利CN102329373采用Fmoc策略固相法依次连接合成地加瑞克，5位氨基酸采用Trt或者Alloc保护，直链肽合成完成后，脱除侧链保护，偶联Hor。然而脱除氨基酸残基4Aph(Trt)的保护基Trt时采用5-10％TFA/DCM，会导致第3个氨基酸残基Lys(ipr，Boc)的保护基Boc的部分脱落，从而裸露的氨基会与L-4，5-二氢乳清酸反应生成新的杂质；另外，脱除氨基酸残基4Aph(Alloc)的保护基Alloc时采用Pd(Ph3P)4/苯硅烷/DCM，Pd(Ph3P)4的价格比较昂贵，会增加规模化生产的成本。同时液相合成Trt或Alloc保护的氨基酸，包括Cbm保护的6位氨基酸时收率很低，较多的杂质在液相合成中极大的增大了纯化的难度和成本。固相载体的取代值限制造成总收率较低；氨基酸投量高，合成成本高；杂质较多，纯化成本高。专利CN102952174、专利CN103992378、专利CN103992392、专利CN104177478、专利CN105085634、专利CN105524143和专利CN107344960是采用Fmoc策略固相法依次连接合成地加瑞克，固相载体的取代值限制造成总收率较低；氨基酸投量高，合成成本高；杂质较多，纯化成本高。专利CN103351428和专利CN107022002采用固相片段缩合的方法合成，固相片段缩合投入的每个片段都是2倍过量，严重浪费肽片段，造成合成成本很高；同时固相片段缩合的树脂取代值限制，物料通量降低，浪费溶剂，产生大量废液。专利CN103180335采用3+4+3、专利CN106589071采用6+4的液相片段缩合的方法合成，其中每个片段也是液相合成，可以看到其中每一步偶合反应都涉及了繁琐的N末端以及C末端的保护和脱保护过程，以及适宜的pH条件的配合，这产生了很大的工作量和废液的排放，耗费时间很长，而且液相合成肽片段的效率远低于固相合成肽片段，分离也有很大难度。可以看到，对地加瑞克的合成方法研究大部分集中在减少杂质和提高纯度上，但实际上现有工艺通过一次或多次制备，都可以得到药物级要求的纯肽。而单纯的为了提高纯度使用更加昂贵的氨基酸保护基或者缩合剂对于规模化和产业化生产的实际需求是没有意义的。如前所述，在地加瑞克的序列中包含了七个非天然氨基酸，其单价是天然氨基酸的数倍甚至几十倍，所以地加瑞克的合成成本是非常高昂的，所以我们认为，在保证产品收率和产品纯度的基础上降低合成成本，甚至牺牲部分收率而大幅降低合成成本、并减少废液产生的新合成方法，对于大规模、产业化生产是非常必要和重要的。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有方法合成收率低、产品杂质多，特别是生产成本高，不能低成本高效率得到高纯度的地加瑞克的缺点，提供一种片段缩合制备地加瑞克的方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：片段缩合制备地加瑞克的方法，固相合成侧链保护的第一肽片段序列和侧链保护的第二肽片段序列，液相合成合成侧链保护的第三肽片段序列，将各肽片段逐步偶联得到全保护的地加瑞克，然后裂解脱除保护基得到地加瑞克粗肽，纯化换盐得到地加瑞克；其中，所述的第一肽片段序列为地加瑞克序列中的第1-4位氨基酸，所述的第二肽片段序列为地加瑞克序列中的第5-8位氨基酸，所述的第三肽片段序列为地加瑞克序列中的第9-10位氨基酸。上述片段缩合制备地加瑞克的方法，优选包括以下步骤：(1)固相分别合成侧链保护的第一肽片段序列和侧链保护的第二肽片段序列，并从树脂上裂解；(2)液相合成侧链保护的第三肽片段序列；(3)将脱去氨基保护基的第三肽片段序列和侧链保护的第二肽片段序列偶联得到侧链保护的第四肽片段序列，并脱去其氨基保护基；(4)将脱去氨基保护基的侧链保护的第四肽片段序列和侧链保护的第一肽片段序列偶联得到全保护的地加瑞克；(5)将全保护的地加瑞克裂解脱除保护基得到地加瑞克粗肽；(6)地加瑞克粗肽经纯化换盐得到地加瑞克。步骤(1)中，侧链保护的第一肽片段序列由Fmoc-D-3Pal-Ser(ψMe，Me)Pro-OH、Fmoc-D-Phe(4-C1)-OH和Ac-D-Nal-OH依次偶联在固相载体上获得；其中，所述的固相载体为酸敏感树脂，优选为2-氯-三苯甲基氯树脂。侧链保护的第一肽片段序列固相合成中，所使用的氨基脱保护试剂为体积百分含量为20％的哌啶的DMF溶液、或者体积百分含量为1％的DBU的DMF溶液；优选体积百分含量为20％哌啶的DMF溶液。所使用的偶联剂为DIC与HOBt按摩尔比1∶1的组合、或者HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1∶1∶2的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA按摩尔比1∶1∶2的组合；优选HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1∶1∶2的组合；待偶联的氨基酸与HOBt的摩尔比是1∶1。所使用的裂解剂为体积百分含量为0.5～1％的TFA的DCM溶液、或者体积百分含量为20％的TFE的DCM溶液、或者TFE与AcOH与DCM按照体积比1∶2∶7的混合物，优选体积百分含量为0.5～1％的TFA的DCM溶液。步骤(1)中，侧链保护的第二肽片段序列由Fmoc-ILys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH和Fmoc-D-Phe(4-NO2)-OH依次偶联在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.片段缩合制备地加瑞克的方法，其特征在于，固相合成侧链保护的第一肽片段序列和侧链保护的第二肽片段序列，液相合成侧链保护的第三肽片段序列，将各肽片段逐步偶联得到全保护的地加瑞克，然后裂解脱除保护基得到地加瑞克粗肽，纯化换盐得到地加瑞克；其中，所述的第一肽片段序列为地加瑞克序列中的第1‑4位氨基酸，所述的第二肽片段序列为地加瑞克序列中的第5‑8位氨基酸，所述的第三肽片段序列为地加瑞克序列中的第9‑10位氨基酸。

【技术特征摘要】
1.片段缩合制备地加瑞克的方法，其特征在于，固相合成侧链保护的第一肽片段序列和侧链保护的第二肽片段序列，液相合成侧链保护的第三肽片段序列，将各肽片段逐步偶联得到全保护的地加瑞克，然后裂解脱除保护基得到地加瑞克粗肽，纯化换盐得到地加瑞克；其中，所述的第一肽片段序列为地加瑞克序列中的第1-4位氨基酸，所述的第二肽片段序列为地加瑞克序列中的第5-8位氨基酸，所述的第三肽片段序列为地加瑞克序列中的第9-10位氨基酸。2.根据权利要求1所述的片段缩合制备地加瑞克的方法，其特征在于，它包括以下步骤：(1)固相分别合成侧链保护的第一肽片段序列和侧链保护的第二肽片段序列，并从树脂上裂解；(2)液相合成侧链保护的第三肽片段序列；(3)将脱去氨基保护基的第三肽片段序列和侧链保护的第二肽片段序列偶联得到侧链保护的第四肽片段序列，并脱去其氨基保护基；(4)将脱去氨基保护基的侧链保护的第四肽片段序列和侧链保护的第一肽片段序列偶联得到全保护的地加瑞克；(5)将全保护的地加瑞克裂解脱除保护基得到地加瑞克粗肽；(6)地加瑞克粗肽经纯化换盐得到地加瑞克。3.根据权利要求2所述的片段缩合制备地加瑞克的方法，其特征在于，步骤(1)中，侧链保护的第一肽片段序列由Fmoc-D-3Pal-Ser(ψMe，Me)Pro-OH、Fmoc-D-Phe(4-C1)-OH和Ac-D-Nal-OH依次偶联在固相载体上获得；其中，所述的固相载体为酸敏感树脂；侧链保护的第一肽片段序列固相合成中，所使用的氨基脱保护试剂为体积百分含量为20％的哌啶的DMF溶液、或者体积百分含量为1％的DBU的DMF溶液；所使用的偶联剂为DIC与HOBt的组合、或者HBTU与HOBt与DIEA的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA的组合；所使用的裂解剂为体积百分含量为0.5～1％的TFA的DCM溶液、体积百分含量为20％的TFE的DCM溶液、或者TFE与AcOH与DCM按照体积比1∶2∶7的混合物。4.根据权利要求2所述的片段缩合制备地加瑞克的方法，其特征在于，步骤(1)中，侧链保护的第二肽片段序列由氨基酸Fmoc-ILys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH和Fmoc-D-Phe(4-NO2)-OH依次偶联在固相载体上，然后肽树脂还原、接侧链保护得到肽树脂Fmoc-D-4Aph(Cbm-tBu)-Leu-ILys(Boc)-Resin；接下来肽树脂脱除Fmoc保护、氨基端偶联Fmoc-Phe(4-NO2)-OH，然后...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭雅丽，王锐，贺真，方泉，许兆青，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62