负载维甲酸的钆参杂四氧化三铁复合纳米粒子的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种多功能负载维甲酸的钆参杂四氧化三铁复合纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：步骤1、制备了Fe/Gd单源前驱体，然后加入到油胺、油酸和苄醚的反应混合物中，逐步升温加热，后冷却至室温，得到黑色/棕色物质，分离，乙醇洗涤，干燥得到Gd:Fe3O4；步骤2、用活性聚合物对Gd:Fe3O4进行表面改性，使其成为水溶液，且表面功能上活性基团羧基，令通过酯键将负载维甲酸的环糊精连在Gd:Fe3O4表面，即：通过纳米材料表面的邻羟基苯‑PEG‑羧基端化合物与载有维甲酸的环糊精表面的羟基进行反应，通过酯键连接，从而制备成Gd:Fe3O4@RA。

Preparation of Gadolinium Heterogeneous Fe3O4 Nanoparticles Supported with Retinoic Acid

The invention relates to a preparation method of gadolinium and ginseng heterotrophic ferric oxide composite nanoparticles loaded with retinoic acid, which includes the following steps: step 1, preparation of Fe/Gd single source precursor, then adding it to the reaction mixture of oleamine, oleic acid and benzyl ether, heating step by step, then cooling to room temperature, obtaining black/brown substance, separation, ethanol washing and drying to obtain Gd:Fe3O4. Step 2: Surface modification of Gd: Fe3O4 with active polymer to form aqueous solution and carboxyl groups of active groups on the surface function, so that the cyclodextrin loaded with retinoic acid can be linked to the surface of Gd: Fe3O4 by ester bond, that is, through the reaction of o-hydroxybenzene PEG carboxyl end compounds on the surface of nanomaterials with hydroxyl groups on the surface of cyclodextrin loaded with retinoic acid, through ester bond bond bond bond. Thus, Gd:Fe3O4@RA was prepared.

【技术实现步骤摘要】
负载维甲酸的钆参杂四氧化三铁复合纳米粒子的制备方法
本专利技术涉及涉及医用生物材料与组织工程
，更具体地涉及一种纳米医用生物材料诱导人干细胞定向分化为神经细胞用于人中枢神经损伤修复的材料和方法。
技术介绍
中枢神经系统是指神经系统的主要部分，包括位于椎管内的脊髓和位于颅腔内的脑。中枢神经损伤所引发的疾病严重影响着人类的健康，且患者众多，主要包括脊髓损伤，创伤性脑损伤，脑中风及帕金森病。期中脊髓损伤的发生率为千分之一，我国目前有约130万脊髓损伤者，且以每年5至7万的速度增长，患者数量呈逐年上升的趋势。脊髓损伤是公认的重度肢体残障群体中最痛苦的一个群体,90％的脊髓损伤者是源自于外伤，高发年龄为20至30岁,多因交通事故、跌落、暴力行为(含自杀)及脊髓疾病而发病。脊髓损伤是一种严重的中枢神经系统损伤,致双下肢或四肢瘫痪,伴随数十种并发症。其治疗一直是世界性难题，目前尚无有效治疗方式。创伤性脑损伤同样是一种外伤性疾病，每年新增大约150万的外伤性脑损伤，因为脑损伤具有多种不同的明确的类型，病灶和基本的损伤范围，而且不同的病理学机制、不同条件二次损伤机制，故到目前为止，外伤性脑损伤还没有针对性的有效治疗手段。脑中风可以分为出血性脑中风，缺血性脑中风和局部血栓等，是世界上第二致死病因，6％的死亡是由于脑中风引起的。期中80％的脑中风为缺血性脑中风，到目前为止缺血性脑中风仍然没有行之有效的治疗方案，目前的治疗方案仅限于血栓溶解和神经保护，但研究表明这些方案只是针对极少的患者才会具有一点效果。帕金森是一类神经退行性疾病，是65岁以上老年人常见疾病。通常帕金森患者运动平衡和思考认知能力均受到严重影响，目前治疗办法为口服可以在体内转化生成多巴胺的L-3,4-二羟基苯丙氨酸进行治疗，而且存在运动障碍的副作用。由于中枢神经难以再生，到目前为止中枢神经损伤仍未找到合理的解决办法，因此中枢神经再生引起了世界学者们的广泛关注，多年来受到研究学者的高度重视。干细胞是指有多向分化潜能和自我更新能力的细胞，这种细胞存在于成年个体的许多组织和胚胎中。近年来，研究证实多种干细胞如神经干细胞，骨髓间充质干细细胞等，具有向神经元细胞分化的潜能，并具有来源充足、获取方便、可进行自体移植的特点，这有效避免了使用干细胞所带来的免疫排斥反应和伦理学争议等优势。目前干细胞医学的兴起，为治疗中枢神经损伤提供了新的解决方案，已成为一个研究热点。但干细胞移植面临几大难题：(1)干细胞移植成活率低，(2)干细胞有效分化率低，存活的神经干细胞不足13％分化成神经元，(3)后期评价方式具有侵入性，传统大多采用处死动物后进行组织切片加以验证干细胞移植后对神经功能或行为是否有改善，不利于对移植后干细胞在活体内的迁移的动态示踪。这些问题严重阻碍了干细胞治疗在科研及临床得推广和应用。近年来，随着纳米技术的迅速发展，其应用领域也越来越广，包括医用生物材料与组织工程
高生物适应性的多功能纳米材料的构建可有效地提高干细胞移植的成活率；其负载的药物和生物分子可提高干细胞定向分化为神经元细胞；其构建的无机元素可有效地提供磁靶向传递以及提供无侵入性的实时动态造影。目前，尚未见经多功能钆参杂四氧化三铁复合纳米粒子诱导人干细胞定向分化用于中枢神经损伤修复及实时MRI造影的方法报道。
技术实现思路
本专利技术设计了一种多功能负载维甲酸的钆参杂四氧化三铁复合纳米粒子的制备方法，其解决的技术问题是现有技术中尚未见经多功能钆参杂四氧化三铁复合纳米粒子诱导人干细胞定向分化用于中枢神经损伤修复及实时MRI造影的方法。为了解决上述存在的技术问题，本专利技术采用了以下方案：一种用于诱导干细胞定向分化及用于实时MRI造影的多功能钆参杂四氧化三铁复合纳米粒子，其中，钆参杂四氧化三铁为MRI造影剂及纳米载体，其负载的维甲酸为活性成分，其具有促进干细胞分化为神经元细胞的作用。本专利技术中，所述的钆参杂四氧化三铁纳米粒子结构式可表述为Gd:Fe3O4,所述的多功能负载维甲酸的钆参杂四氧化三铁纳米粒子的结构式可表述为Gd:Fe3O4@RA,其中：@为负载的意思，RA代表着维甲酸。本专利技术中，所述的Gd:Fe3O4及Gd:Fe3O4@RA是由以下方法制备，包括以下步骤：步骤1、制备了Fe/Gd单源前驱体，然后加入到油胺、油酸和苄醚的反应混合物中，逐步升温加热，后冷却至室温，得到黑色/棕色，分离，乙醇洗涤再分离，干燥得到Gd:Fe3O4。步骤2、用活性聚合物对Gd:Fe3O4进行表面改性，使其成为水溶液，且表面功能上活性基团羧基，令通过酯键将负载维甲酸的环糊精连在Gd:Fe3O4表面，即：通过纳米材料表面的邻羟基苯-PEG-羧基端化合物与载有维甲酸的环糊精表面的羟基进行反应，通过酯键连接，从而制备成Gd:Fe3O4@RA。步骤1中Fe/Gd单源前驱体通过Fe源和Gd源制备，其中摩尔比为5：3。步骤1中的逐步升温包括两个进程，分别为100-200℃加热30分钟，200-350℃加热30分钟。步骤1中升温加热过程需要在惰性气体保护下进行步骤1中的制备的Gd:Fe3O4的直径为7-10nm,较小的直径有益于其进入细胞和减少细胞毒性。步骤2中活性聚合物为邻羟基苯-PEG-羧基端化合物，平均分子量为4000-8000。步骤2中表面修饰活性聚合物后，需要搅拌条件下，在蒸馏水中透析24小时除去未连接的聚合物。步骤2中，在酸性和加热约80℃的条件下，将载有维甲酸的环糊精通过酯键将其羟基与纳米粒子表面的活性基团羧基进行反应，从而制备Gd:Fe3O4@RA。步骤2中，制备的Gd:Fe3O4@RA需要通过丙烯葡聚糖凝胶进行提纯，待用。步骤2中，制备的Gd:Fe3O4@RA溶于水溶液中得到水溶液或冻干保存。本专利技术的机理为：本专利技术的Gd:Fe3O4@RA纳米粒子应用于干细胞的定向分化为神经原细胞用于中枢神经损伤的修复，同时用于实时的MRI造影考察干细胞移植后对神经功能或行为的作用，和在活体内的迁移的动态示踪。毒性检测证明本专利技术的Gd:Fe3O4和Gd:Fe3O4@RA对神经干细胞及间充质干细胞等几乎没有毒性。免疫荧光染色证明了Gd:Fe3O4@RA具有促进经干细胞及间充质干细胞等定向分化为神经元细胞。同时，通过在大鼠脊髓损伤病灶区注射标记有Gd:Fe3O4@RA的神经干细胞，可有效用于用于脊髓损伤的修复，并可对病灶区进行实时的MRI加权造影，同时也可清楚实时观测到注射的干细胞在体内的聚集，分化和迁移状态。该多功能负载维甲酸的钆参杂四氧化三铁复合纳米粒子的制备方法具有以下有益效果：(1)本专利技术采用简单的方式制备Gd:Fe3O4@RA纳米粒子，此法工艺简单，反应条件温和，易于操作分离，环境友好，价格低廉，重复性强，具有产业化实施的前景(2)本专利技术提出的Gd:Fe3O4@RA纳米粒子在干细胞的神经元分化中的应用，并提出用于中枢神经损伤的修复及MRI无侵实时造影。附图说明图1是本专利技术中Gd:Fe3O4@RA纳米粒子的透射电镜图A。图2是本专利技术中Gd:Fe3O4@RA纳米粒子的透射电镜图B。图3是本专利技术中移植Gd:Fe3O4@RA标记的干细胞后第七天，大鼠脊柱的MRI成像，其中白色亮点为Gd:Fe3O4@RA标记的干细胞聚集区域，黑色区域为脊髓损本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多功能负载维甲酸的钆参杂四氧化三铁复合纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：步骤1、制备了Fe/Gd单源前驱体，然后加入到油胺、油酸和苄醚的反应混合物中，逐步升温加热，后冷却至室温，得到黑色/棕色物质，分离、乙醇洗涤再分离，干燥得到Gd:Fe3O4；步骤2、用活性聚合物对Gd:Fe3O4进行表面改性，使其成为水溶液，且表面功能上活性基团羧基，令通过酯键将负载维甲酸的环糊精连在Gd:Fe3O4表面，即：通过纳米材料表面的邻羟基苯‑PEG‑羧基端化合物与载有维甲酸的环糊精表面的羟基进行反应，通过酯键连接，从而制备成Gd:Fe3O4@RA。

【技术特征摘要】
1.一种多功能负载维甲酸的钆参杂四氧化三铁复合纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：步骤1、制备了Fe/Gd单源前驱体，然后加入到油胺、油酸和苄醚的反应混合物中，逐步升温加热，后冷却至室温，得到黑色/棕色物质，分离、乙醇洗涤再分离，干燥得到Gd:Fe3O4；步骤2、用活性聚合物对Gd:Fe3O4进行表面改性，使其成为水溶液，且表面功能上活性基团羧基，令通过酯键将负载维甲酸的环糊精连在Gd:Fe3O4表面，即：通过纳米材料表面的邻羟基苯-PEG-羧基端化合物与载有维甲酸的环糊精表面的羟基进行反应，通过酯键连接，从而制备成Gd:Fe3O4@RA。2.根据权利要求1所述多功能负载维甲酸的钆参杂四氧化三铁复合纳米粒子的制备方法，其特征在于：步骤1中Fe/Gd单源前驱体通过Fe源和Gd源制备，其中两者的摩尔比为5：3。3.根据权利要求1所述多功能负载维甲酸的钆参杂四氧化三铁复合纳米粒子的制备方法，其特征在于：步骤1中的逐步升温加热包括两个进程，分别为100-200℃加热30分钟，200-350℃加热30分钟，步骤1中逐步升温加热需要在惰性气体保护下进行。4.根据权利要求1所述多功能负载维甲酸的钆参杂四氧化三铁复合纳米粒子的制备方法，其特征在于：步骤1中的制备的Gd:Fe3O4的直径为7-10nm,该较小的直径有益于其进入细胞和减少细胞毒性。5.根据权利要求1所述多功能负载维甲酸的钆参杂四氧化三铁复合纳米粒子的制备方法，其特征在于：步骤2中活性聚合物为邻羟基苯-PEG-羧基端化合物，平均分子量为4000-8000。6.根据权利要求1所述多功能负载维甲酸的钆参杂四氧化三铁复合纳米粒子的制备方法，其特征在于：步骤2中表面修饰活性聚合物后，需要搅拌条件下，在蒸馏水中透析24小时除去未连接的聚合物。7.根据权利要求1所述多功能负载维甲酸的钆参杂四氧化三铁复合纳米粒子的制备方法，其特征在于：步骤2中，在酸性和加热约80℃的条件下，将载有维甲酸的环糊精通过酯键将其羟基与纳米粒子表面的活性基团羧基进行反应，从而制备Gd:Fe3O4@RA。8.根据权利要求1所述多功能负载维甲酸的钆参杂四氧化三铁复合纳米粒子的制备方法，其特征在于：步骤2中，制备的Gd:Fe3O4@RA通过丙烯葡聚糖凝胶进行提纯。9.根据权利要求1-8中任何一项所述多功能负载维甲酸的钆参杂四氧化三铁复合纳米粒子的制...

【专利技术属性】
技术研发人员：王冠男，金丽，代晨，谭文彬，蔡莎莎，
申请(专利权)人：济宁医学院，
类型：发明
国别省市：山东,37