一种靶向人低分化胃癌细胞的核酸适配体及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物医学技术领域，具体涉及一种靶向人低分化胃癌细胞的核酸适配体及其应用。所述核酸适配体序列为5’‑ACACCAAAATCGTCCGTTTCGTTTTAGTCCGTCTCTTTAGGGTGT‑3’。本发明专利技术所述的核酸适配体具有高特异性、高亲和力，在4℃，25℃，37℃均能保持良好活性。本发明专利技术的核酸适配体可作为分子探针，对人低分化胃癌细胞进行特异性成像和检测。在低分化胃癌的预测和诊治方面具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种靶向人低分化胃癌细胞的核酸适配体及其应用
本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种靶向人低分化胃癌细胞的核酸适配体及其应用。
技术介绍
胃癌是常见高发的恶性肿瘤，也是全球癌症死亡的第三大原因。根据腺体的分化程度，胃癌可分为分化型和未分化型。临床研究显示，中高分化胃癌，恶性程度较低，预后较好；而低分化胃癌，恶性程度较高，预后较差。此外，胃癌的分化状态还与化疗效果具有相关性。因此，准确区分胃癌组织的分化状态，对于判断预后以及指导低分化胃癌的治疗具有重要意义。但目前对胃癌组织分化状态的判断主要基于对病理切片的形态学观察，缺少基于分子标志物的高灵敏度、高特异性检测探针及方法。核酸适配体（aptamer）是采用指数富集的配基系统进化技术（SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialenrichment，SELEX）从大容量RNA/单链DNA随机文库中筛选得到的能与靶标物质特异性结合的寡核苷酸序列，被称为化学抗体。与传统的抗体相比，具有特异性强，亲和力高，稳定性好，易于进行化学修饰形成各种形式的分子探针等特点。消减Cell-SELEX是以完整细胞作为靶标进行核酸适配体筛选的技术，由于使用具有功能表型差异的靶细胞和非靶细胞进行消减筛选，可获得针对特定功能表型细胞的核酸适配体。由于筛选出的核酸适配体主要与细胞表面分子结合，特别适合用来制备分子探针进行靶细胞靶向成像分析以及作为靶向载体等。有研究将高转移细胞与低转移细胞进行消减筛选，得到能与转移细胞特异性结合的核酸适配体；有研究将病毒感染细胞与非感染细胞进行消减筛选，制备了可以特异性检测病毒感染的核酸适配体分子探针。但目前未见以低分化胃癌细胞为靶细胞，以中高分化胃癌细胞为非靶细胞，筛选人低分化胃癌细胞特异性核酸适配体的报道。
技术实现思路
鉴于现有技术存在的缺陷，本专利技术提供了一种以人低分化胃癌细胞BGC-823为靶细胞，以中分化胃癌细胞SGC-7901为非靶细胞，经过消减Cell-SELEX技术筛选得到的能够与人低分化胃癌细胞特异性结合的核酸适配体，可以制备成分子探针进行人低分化胃癌细胞/组织的靶向成像等应用。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案。一种靶向人低分化胃癌细胞的核酸适配体，所述核酸适配体序列如SEQIDNO.1所示：5’-ACACCAAAATCGTCCGTTTCGTTTTAGTCCGTCTCTTTAGGGTGT-3’。所述的核酸适配体在人低分化胃癌细胞特异性成像中的应用。所述肿瘤包括胃癌、低分化胃癌。所述的核酸适配体在鉴定核酸适配体靶标中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下。1.提供了一种新的能够靶向人低分化胃癌细胞的核酸适配体序列。所述核酸适配体具有高亲和力和高特异性：对靶细胞的解离常数Kd值为纳摩尔级（35.2±1.1nM）；对靶细胞及其它低分化胃癌细胞结合能力强，对非靶细胞及其它中高分化胃癌细胞结合能力弱或不结合，对正常细胞不结合。2.由于对靶细胞的结合具有高亲和力和高特异性，以及良好的温度稳定性，所述核酸适配体特别适合作为分子探针进行组织的靶向成像。采用所述核酸适配体结合量子点构建量子点探针进行胃癌患者组织的成像分析，结果显示了明显的低分化组织特异性，荧光强度为低分化组织＞中高分化组织＞正常癌旁组织。附图说明图1为实施例中流式细胞术检测所述核酸适配体对靶细胞BGC-823的特异性结合结果。图2为实施例中荧光显微镜技术分析所述核酸适配体与靶细胞BGC-823的特异性结合结果。图3为实施例中流式细胞术测定所述核酸适配体对靶细胞BGC-823的解离常数结果。图4为实施例中流式细胞术检测所述核酸适配体对不同细胞的结合能力。图5为实施例中流式细胞术检测所述核酸适配体在不同温度下与靶细胞的结合活性结果。图6为实施例中荧光显微镜技术分析所述核酸适配体对混合细胞中靶细胞的靶向成像结果。图7为实施例中所述核酸适配体对临床组织标本的靶向成像结果。具体实施方式下面结合附图和实施例详细描述本专利技术，以下所述仅是本专利技术的优选实施方式，应当指出，对于本
的普通技术人员，在不脱离本专利技术方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本专利技术的保护范围。实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。洗涤缓冲液（pH=7.4）是溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其在溶剂中的浓度为：4.5g/L葡萄糖、137mMNaCl、2.7mMKCl、2mMKH2PO4、5mMMgCl2、1mMCaCl2。结合缓冲液（pH=7.4）是含有1mg/mlBSA和0.1mg/ml鲱鱼精DNA的洗涤缓冲液。实施例1核酸适配体的筛选。(1)随机筛选文库的准备。委托生工生物工程股份有限公司合成随机单链DNA文库（5’-AAGGAGCAGCGTGGAGGATANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTAGGGTGTGTCGTCGTGGT-3’）；取1管10OD的随机单链DNA文库，加入结合缓冲液，涡旋震荡溶解，盖好离心管盖，95℃水浴5min，迅速加入冰上8min，备用。(2)人胃癌细胞BGC-823正筛：BGC-823细胞(购于上海中科院细胞库)培养至对数生长期，洗涤缓冲液洗涤两次，将步骤(1)准备的随机文库加入BGC-823细胞中，4℃摇床震荡1h；弃上清；洗涤缓冲液洗涤BGC-823细胞三次；用细胞刮将BGC-823细胞刮下，用1mL洗涤缓冲液将BGC-823细胞重悬，移入至离心管中，95℃水浴5min，1000rpm室温离心5min，留取上清。(3)PCR扩增：取100µL步骤(2)所得的上清样品，加入到1mLPCRmix液中；涡旋振荡混匀后，按每管50µL分装进行PCR扩增，扩增条件为：94℃加热预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，12个循环。其中1mLPCRmix液中含有：ddH2O865µL；10×PCR缓冲液100µL；上游引物：5’-FAM-AAGGAGCAGCGTGGAGGATA-3’；下游引物。5’-biotin-ACCACGACGACACACCCTAA-3’各5µL；rTaq酶5µL；dNTP20µL。所述上下游引物均委托生工生物工程股份有限公司合成。(4)单链DNA的制备：将60µL链霉亲和素琼脂糖珠悬液(购于GEHealthcase公司)在5000rpm转速下离心取上清，沉淀用PBS洗涤，离心取上清；重复洗涤一次。将步骤(3)中PCR扩增所得的扩增产物与洗涤后的链霉亲和素琼脂糖珠在常温下孵育30min，通过扩增产物双链DNA上的生物素与琼脂糖珠上的链霉亲和素发生亲和作用，得到结合有双链DNA的琼脂糖珠上，5000rpm转速下离心去上清，沉淀用PBS离心洗涤两次；然后加入200µL0.1MNaOH溶液常温下与沉淀孵育10min，使琼脂糖珠上的双链DNA变性。将碱变性反应得到的反应液在5000rpm离心2min，收集上清。(5)脱盐：将脱盐柱(购于GEHealthcase公司)用15mL无菌水洗涤后，加入步骤(4)中经过碱变性后得到的上清液，自然滴完，然后加入本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向人低分化胃癌细胞的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体序列为：5’‑ACACCAAAATCGTCCGTTTCGTTTTAGTCCGTCTCTTTAGGGTGT‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种靶向人低分化胃癌细胞的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体序列为：5’-ACACCAAAATCGTCCGTTTCGTTTTAGTCCGTCTCTTTAGGGTGT-3’。2.一种靶向人低分化胃癌细胞的核酸适配体的应用，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：方瑾，李婉明，
申请(专利权)人：中国医科大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21