本发明专利技术涉及生物技术和甲壳动物生长发育调控领域，具体涉及一种调控日本沼虾生长发育的类胰岛素受体基因及其应用。类胰岛素受体基因(ILPR基因)如SEQ ID NO:1中核酸所示。根据ILPR基因的开放阅读框设计RNA干扰引物，将双链RNA(dsRNA)注射到日本沼虾体内，可有效降低ILPR基因的表达水平；同时使日本沼虾生长显著变缓。本发明专利技术首次在甲壳动物中克隆ILPR基因的mRNA序列，首次明确了ILPR基因具有调控日本沼虾生长发育的功能，为日本沼虾的良种选育和生产性能的开发利用提供了重要的经济性状候选基因。
【技术实现步骤摘要】
一种调控日本沼虾生长发育的类胰岛素受体基因及其应用
本专利技术涉及生物技术和甲壳动物生长发育调控领域，具体涉及一种调控日本沼虾生长发育的类胰岛素受体基因及其应用。
技术介绍
日本沼虾(Macrobrachiumnipponense)，俗称青虾、河虾，隶属于甲壳纲、十足目、长臂虾科、沼虾属。具有适应性强、生长速度快、繁殖力强、个体大、营养丰富等特点，是我国大规模养殖的淡水经济虾类中唯一的本土品种。据《2018年中国渔业统计年鉴》统计，2017年我国日本沼虾养殖年产量为240,739吨。日本沼虾养殖已经成为广大渔民增产创收的重要手段之一，在我国的水产养殖中发挥着重要作用。近年来随着养殖规模和养殖面积的不断扩大，日本沼虾生产性能下降和种质资源退化的现象日益突出，其中个体小型化尤为明显，最终导致商品虾的规格降低，严重影响了日本沼虾的品质和经济效益。因此，挖掘调控日本沼虾生长发育的重要基因，进而阐明其生长发育机制就成为当前日本沼虾良种选育研究中亟待解决的课题。就甲壳动物的生长发育而言，由于几丁质外骨骼的存在，有关甲壳动物生长发育的研究多集中于蜕皮机制的调控方面。不可否认，蜕皮机制的确在甲壳动物的生长发育过程中发挥重要作用。但是更应清醒地认识到，生长基因及信号通路才是甲壳动物生长发育的主导因素，而甲壳动物的生长相关基因还鲜有报道。因此探索日本沼虾生长相关基因不但可以为日本沼虾的良种选育提供重要的靶标基因，而且有助于丰富甲壳动物的生长发育理论。研究表明，蛋白类激素所调控的生物学过程都是首先与其受体结合，进而开启一系列的相关信号通路，最终发挥应有的生物学功能。例如，在脊椎动物中，血糖水平的调控主要依赖于胰岛素受体(Insulinreceptor,InR)所介导的胰岛素信号通路。在无脊椎动物中，如线虫、软体动物和昆虫中，也存在与脊椎动物胰岛素序列相似的蛋白，通常命名为类胰岛素(Insulin-like/relatedpeptides，ILP)。类胰岛素受体(ILPreceptor，ILPR)作为其受体，介导ILP开启胰岛素信号通路(Insulinsignalingpathway，ISP)、丝裂源活化蛋白激酶(Mitogenactivatedproteinkinase，MAPK)通路信号、雷帕霉素靶蛋白(Targetofrapamycinpathway，TOR)信号通路，调控新陈代谢、繁殖、免疫等多种生命过程。据此可见，ILPR是ILP生物学功能的效应器。因此阐明ILPR基因的功能，无疑将有助于全面解析“ILP/ILPR”调控通路“背后”的分子机制。但是迄今为止，有关甲壳动物ILPR基因的mRNA序列和“承担”的生物学功能还未见报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种调控日本沼虾生长发育的类胰岛素受体基因及其应用。为实现上述目的，本专利技术采用技术方案为：一种调控日本沼虾生长发育的类胰岛素受体基因，类胰岛素受体基因(ILPR基因)如SEQIDNO:1中核酸所示。一种所述的类胰岛素受体基因在调控日本沼虾生长发育中的应用。进一步的说，所述由SEQIDNO:1序列所示ILPR基因,利用RNA干扰(RNAinterference，RNAi)技术体外合成如SEQIDNO:5所示的双链RNA(dsRNA)，所得双链RNA(dsRNA)在调控日本沼虾生长发育中的应用。再进一步的说，所述双链RNA(dsRNA)为利用RNA干扰技术，根据SEQIDNO:1序列所示ILPR基因的开放阅读框设计干扰引物，以日本沼虾的肌肉总RNA为模板进行PCR反应，得到的序列如SEQIDNO:4所示；再以所得PCR反应液为模板进行体外合成如SEQIDNO:5所示的双链RNA(dsRNA)。所述根据SEQIDNO:1序列所示ILPR基因的开放阅读框设计干扰引物为正向上游引物序列如SEQIDNO:2所示，反向下游引物序列如SEQIDNO:3所示。所述dsRNA注射剂量为5μg/g。本专利技术所具有的有益效果：本专利技术通过日本沼虾ILPR基因获得其dsRNA，通过显微注射的方式将dsRNA注入日本沼虾围心腔内，结果表明：干扰ILPR基因会导致日本沼虾的蜕皮周期延长、生长变缓。该基因在dsRNA刺激下的表达量变化及其对日本沼虾生长的影响，证明了ILPR基因可以调控日本沼虾的生长发育，该研究结果为日本沼虾的良种选育提供新的生长靶标基因。附图说明图1为本专利技术实施例提供的雄性日本沼虾注射dsRNA-ILPR后的干扰效率图；其中，7d、14d、21d和28d分别是指注射后第7天、第14天、第21天和第28天。**代表P<0.01，干扰组为注射dsRNA-ILPR，对照组为注射相同剂量的DEPC水。图2为本专利技术实施例提供的雌性日本沼虾注射dsRNA-ILPR后的干扰效率图；其中，7d、14d、21d和28d分别是指注射后第7天、第14天、第21天和第28天。**代表P<0.01，干扰组为注射dsRNA-ILPR，对照组为注射相同剂量的DEPC水。具体实施方式以下结合实例对本专利技术的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本专利技术，并不局限于本专利技术。本专利技术从日本沼虾的肌肉中克隆获得ILPR基因；根据ILPR基因的开放阅读框设计RNA干扰引物，将双链RNA(dsRNA)注射到日本沼虾体内，可有效降低ILPR基因的表达水平；同时使日本沼虾生长显著变缓。本专利技术首次在甲壳动物中克隆ILPR基因的mRNA序列，首次明确了ILPR基因具有调控日本沼虾生长发育的功能，为日本沼虾的良种选育和生产性能的开发利用提供了重要的经济性状候选基因。实施例1：日本沼虾ILPR基因全长cDNA的获得总RNA提取：选取3g左右的日本沼虾(雄、雄各两只)，取其肌肉，放入盛有液氮的预冷研钵中，迅速研磨。使用Takara公司的RNAisoPlus提取试剂结合传统的酚仿抽提法进行提取肌肉的总RNA。经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，分光光度计分析该样品OD260/280比值在1.8～2.0之间，并测定RNA的浓度。cDNA第一链合成：以上述RNA为模板，按照TakaraM-MLV反转录试剂盒说明书进行第一链cDNA的合成。日本沼虾ILPR全长cDNA序列的克隆：根据日本沼虾肌肉转录组的中间片段设计两组引物进行中间片段的验证(两组引物扩增片段有重叠部分，以便于拼接)：正向引物MF1(SEQIDNO:6)和反向引物MR1(SEQIDNO:7)，正向引物MF2(SEQIDNO:8)和反向引物MR2(SEQIDNO:9)。PCR扩增反应体系如下：PCR反应程序为：94℃预变性3min，然后进入下列循环：94℃30s，55℃30s，72℃90s，30个循环，最后72℃延伸5min，4℃保存。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。利用上海生工生物工程有限公司(Sangon)的柱式DNA胶回收试剂盒进行目的片段的回收，将产物连接到pMD18-T载体(Takara)，并转化入大肠杆菌DH5α，进行蓝白斑筛选，挑取单克隆白斑扩增培养后，将插入目的片段的阳性克隆送至上海铂尚生物公司进行测序分析。根据ILPR基因cDNA中间片段序列，设计特异性正向引物3F(SEQIDNO:10)和本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种调控日本沼虾生长发育的类胰岛素受体基因，其特征在于：类胰岛素受体基因(ILPR基因)如SEQ ID NO:1中核酸所示。
【技术特征摘要】
1.一种调控日本沼虾生长发育的类胰岛素受体基因，其特征在于：类胰岛素受体基因(ILPR基因)如SEQIDNO:1中核酸所示。2.一种权利要求1所述的类胰岛素受体基因在调控日本沼虾生长发育中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述由SEQIDNO:1序列所示ILPR基因,利用RNA干扰(RNAinterference，RNAi)技术体外合成如SEQIDNO:5所示的双链RNA(dsRNA)，所得双链RNA(dsRNA)在调控日本沼虾生长发育中的应用。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述双链RNA(dsRNA)为...
【专利技术属性】
技术研发人员：李法君，李婷婷，付春鹏，张玉兰，
申请(专利权)人：潍坊科技学院，
类型：发明
国别省市：山东,37
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