16,17-EpDPE在制备肺癌治疗药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了16,17‑EpDPE在制备抗肺癌药物中的应用，16,17‑EpDPE本身无毒副作用，且可以有效抑制肺癌细胞的增值和侵袭迁移，可作为肺癌治疗的有效药物，具有良好的基础及临床应用前景。

【技术实现步骤摘要】
16,17-EpDPE在制备肺癌治疗药物中的应用
本专利技术属于肺癌治疗药物研发领域，具体涉及16,17-EpDPE在制备肺癌治疗药物中的应用。
技术介绍
恶性肿瘤是严重危害人类健康的三大主要死亡原因之一，全世界每年约有820万人死于恶性肿瘤。肺癌无论在世界范围内还是在中国，均为发病率与死亡率最高的恶性肿瘤，在2015年，肺癌的死亡率分别占据男性的23.6％和女性的13.8％，其五年生存率只有10-15％，在过去的三十年中几乎没有提高。侵袭和转移是恶性肿瘤最主要的生物学行为，是导致肺癌病人死亡的主要原因，攻克这一难关有可能在肿瘤治疗上取得突破。近年来人们发现肿瘤的侵袭与转移与体内脂类物质及其代谢密切相关。多不饱和脂肪酸(PUFAs)是指含有两个或两个以上不饱和双键且碳链长度在18-22个碳原子的直链脂肪酸。ω-6和ω-3PUFAs只能从膳食中摄入，均为人体必需脂肪，在体内二者比例接近1:1时最有利于健康，在研究恶性肿瘤方面，许多学者认为ω-3PUFAs对恶性肿瘤具有抑制作用，而ω-6PUFAs则发挥相反的作用。ω-6PUFAs和ω-3PUFAs在脂加氧酶和环氧合酶的氧化作用下能够产生多种类型代谢产物，主要为类二十烷酸。其中部分类二十烷酸已被证实参与了多种肿瘤的发生和进展，包括结肠癌、乳腺癌、前列腺癌和肝癌，但是目前国内外一直缺乏16,17-EpDPE对肺癌治疗作用的系统性研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供16,17-EpDPE作为肺癌治疗药物的应用。本专利技术所要解决的技术问题是提供16,17-EpDPE作为肺癌治疗药物，以解决现有技术中，肺癌治疗药物毒副作用大的缺陷。16,17-EpDPE在制备肺癌治疗药物中的应用在本专利技术的保护范围之内。16,17-EpDPE本身无毒副作用，不仅可以有效抑制肺癌细胞的增值和侵袭迁移，而且可以抑制肿瘤相关miR-17的表达，其机制是通过抑制肺癌细胞内AKT和ERK信号通路来实现的。有益效果：本专利技术提供了一种新的制备肺癌治疗药物的方法，本专利技术所述的16,17-EpDPE本身无毒副作用，且可以在体外实验中有效抑制肺癌细胞的增值，迁移和侵袭。可作为肺癌治疗的有效药物，具有良好的基础及临床应用前景。附图说明图1，16,17-EpDPE对肺癌细胞增殖和侵袭的影响图2，16,17-EpDPE对肺癌细胞侵袭的影响图3，16,17-EpDPE对肺癌细胞迁移的影响图4，16,17-EpDPE对肺癌细胞内p-AKT和p-Erk表达水平的抑制作用图5，16,17-EpDPE对肺癌细胞内miR-17表达水平的抑制作用具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本专利技术。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本专利技术，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本专利技术。本专利技术通过体外实验中16,17-EpDPE抑制肺癌细胞增值，迁移和侵袭作用来研究16,17-EpDPE对肺癌的治疗作用。实施例1：为了探讨16,17-EpDPE对肺癌细胞增殖，迁移和侵袭能力的影响，我们采用CCK-8试剂和transwell实验分别检测了细胞的增殖能力和侵袭能力的变化。细胞增殖率检测实验：取对数生长期的A549肺癌细胞，用0.25％胰蛋白酶进行消化，吹打均匀，制备单细胞悬液。按照每孔100μl细胞悬液(含1×104个细胞)接种于96孔细胞培养板内，每组设6个复孔，置于37℃培养箱内孵育24h。再分别给予不同浓度的16,17-EpDPE进行实验处理，继续37℃孵育24h-72h。取出96孔培养板，每孔加入10μlWST试剂，置于37℃培养箱内继续孵育1-2h，用酶联免疫检测仪ELX800读取OD450数值，计算细胞增殖率。细胞增殖率(％)＝(OD450实验组-OD450本底)/(OD450对照组-OD450本底)×100％划痕实验：.先用记号笔在6孔板背后，画横线，大约每隔0.5～1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线，划线时注意线不要太粗。再在六孔板中加入约5*105个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满。.第二天用枪头，尽量垂至于细胞平面，沿着前一天在平板背后的线在细胞层上进行划痕。然后用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基或丝裂霉素抑制细胞增殖。将细胞.放入37度5％CO2培养箱继续培养。按照实验设计，在不同时间点取样，拍照，计算细胞间距离的均值。细胞侵袭率检测实验：取12孔transwell小室，首先在小室膜上表面包被10％Matrigel溶液50μl，在小室膜下表面包被1％明胶溶液，室温晾干。1％明胶溶液采用PBS配制，消毒后使用。取对数生长期的细胞，用0.25％胰蛋白酶消化并收集细胞，加入无血清DMEM培养基，吹打混匀制备单细胞悬液。按每孔100μl细胞悬液(含5×104个细胞)接种于transwell小室内，每组设3个复孔，并给予不同浓度的16,17-EpDPE进行实验处理。再将1ml含有10％FBS的完全DMEM培养基直接加入12孔板小孔内，使得transwell小室内外存在血清浓度差异，从而诱导细胞迁移。实验处理12h-24h后，取出小室，置于冰甲醇中固定30min，室温下自然晾干。PBS洗涤5min×2，采用0.1％结晶紫溶液浸泡小室下表面30min，将细胞染成紫色。再用PBS洗涤5min×3以上，至洗液变清澈。用湿棉签小心擦去小室膜上表面的细胞，室温下自然晾干。将小室置于倒置相差显微镜下，观察迁移至小室膜下表面的细胞并拍照保存。最后在12孔板内加入10％乙酸溶液300μl，将小室下表面浸泡10min，溶解细胞中的结晶紫颗粒。吸取各孔100μl紫色溶液置于新96孔酶联板中，用酶联免疫检测仪ELX800于波长570nm处读取OD570数值，计算细胞侵袭率。细胞侵袭率(％)＝(OD450实验组-OD450本底)/(OD450对照组-OD450本底)×100％实验结果发现16,17-EpDPE能够明显抑制肺癌细胞的增殖(图1)、侵袭(图2)和迁移能力(图3)，并且具有浓度依赖性，数据以均数±标准差表示，*p<0.05，与对照组相比具有统计学差异，表明16,17-EpDPE具有肺癌治疗作用。实施例2：为了探讨DHA代谢产物16,17-EpDPE抑制肺癌细胞增殖和侵袭能力的作用机制，我们采用westernblotting实验分别检测了16,17-EpDPE对肺癌细胞内p-AKT和p-Erk表达水平的变化。采用6孔板培养肺癌A549细胞，加入不同浓度的16,17-EpDPE处理30分钟，弃培养基，PBS洗涤1min×3，每孔加入适量三去污细胞裂解液中，冰上静置30min。用细胞刮匙轻轻将细胞刮下，转移入新1.5mlEP管中，12000g30min离心弃沉淀，细胞总蛋白即在上清液中，接着采用蛋白印迹法检测目的蛋白在各处理细胞中的表达。实验结果显示，实验结果发现16,17-EpDPE能够浓度依赖性的抑制肺癌细胞内的p-AKT和p-Erk的表达(图4)。实施例3：同时采用了realtime-PCR的方法来检测了肺癌细胞中miR-17的表达水平，miR-17是公认的促癌基因，采用试剂盒抽提16,17-EpDPE处理后A549细胞中的RNA，经逆转录后进行实时定本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.16,17‑EpDPE在制备肺癌治疗药物中的应用，所述16,17‑EpDPE的结构式如式(Ⅰ)所示：

【技术特征摘要】
1.16,17-EpDPE在制备肺癌治疗药物中的应用...

【专利技术属性】
技术研发人员：白小明，潘金顺，尤强，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32