Gd:Fe3O4@RA纳米粒子诱导神经干细胞定向分化为神经元细胞的方法技术

本发明专利技术涉及一种Gd:Fe3O4@RA纳米粒子诱导神经干细胞定向分化为神经元细胞的实验方法，包括以下步骤：在培养板中放入预先用多聚赖氨酸处理的盖玻片，将来源于大鼠胚胎脑海马的原代和传代神经干细胞以1×10

【技术实现步骤摘要】
Gd:Fe3O4@RA纳米粒子诱导神经干细胞定向分化为神经元细胞的方法
本专利技术涉及涉及医用生物材料与组织工程
，更具体地涉及一种纳米医用生物材料诱导人干细胞定向分化为神经细胞用于人中枢神经损伤修复的材料和方法。
技术介绍
中枢神经系统是指神经系统的主要部分，包括位于椎管内的脊髓和位于颅腔内的脑。中枢神经损伤所引发的疾病严重影响着人类的健康，且患者众多，主要包括脊髓损伤，创伤性脑损伤，脑中风及帕金森病。期中脊髓损伤的发生率为千分之一，我国目前有约130万脊髓损伤者，且以每年5至7万的速度增长，患者数量呈逐年上升的趋势。脊髓损伤是公认的重度肢体残障群体中最痛苦的一个群体,90％的脊髓损伤者是源自于外伤，高发年龄为20至30岁,多因交通事故、跌落、暴力行为(含自杀)及脊髓疾病而发病。脊髓损伤是一种严重的中枢神经系统损伤,致双下肢或四肢瘫痪,伴随数十种并发症。其治疗一直是世界性难题，目前尚无有效治疗方式。创伤性脑损伤同样是一种外伤性疾病，每年新增大约150万的外伤性脑损伤，因为脑损伤具有多种不同的明确的类型，病灶和基本的损伤范围，而且不同的病理学机制、不同条件二次损伤机制，故到目前为止，外伤性脑损伤还没有针对性的有效治疗手段。脑中风可以分为出血性脑中风，缺血性脑中风和局部血栓等，是世界上第二致死病因，6％的死亡是由于脑中风引起的。期中80％的脑中风为缺血性脑中风，到目前为止缺血性脑中风仍然没有行之有效的治疗方案，目前的治疗方案仅限于血栓溶解和神经保护，但研究表明这些方案只是针对极少的患者才会具有一点效果。帕金森是一类神经退行性疾病，是65岁以上老年人常见疾病。通常帕金森患者运动平衡和思考认知能力均受到严重影响，目前治疗办法为口服可以在体内转化生成多巴胺的L-3,4-二羟基苯丙氨酸进行治疗，而且存在运动障碍的副作用。由于中枢神经难以再生，到目前为止中枢神经损伤仍未找到合理的解决办法，因此中枢神经再生引起了世界学者们的广泛关注，多年来受到研究学者的高度重视。干细胞是指有多向分化潜能和自我更新能力的细胞，这种细胞存在于成年个体的许多组织和胚胎中。近年来，研究证实多种干细胞如神经干细胞，骨髓间充质干细细胞等，具有向神经元细胞分化的潜能，并具有来源充足、获取方便、可进行自体移植的特点，这有效避免了使用干细胞所带来的免疫排斥反应和伦理学争议等优势。目前干细胞医学的兴起，为治疗中枢神经损伤提供了新的解决方案，已成为一个研究热点。但干细胞移植面临几大难题：(1)干细胞移植成活率低，(2)干细胞有效分化率低，存活的神经干细胞不足13％分化成神经元，(3)后期评价方式具有侵入性，传统大多采用处死动物后进行组织切片加以验证干细胞移植后对神经功能或行为是否有改善，不利于对移植后干细胞在活体内的迁移的动态示踪。这些问题严重阻碍了干细胞治疗在科研及临床得推广和应用。近年来，随着纳米技术的迅速发展，其应用领域也越来越广，包括医用生物材料与组织工程
高生物适应性的多功能纳米材料的构建可有效地提高干细胞移植的成活率；其负载的药物和生物分子可提高干细胞定向分化为神经元细胞；其构建的无机元素可有效地提供磁靶向传递以及提供无侵入性的实时动态造影。目前，尚未见经多功能钆参杂四氧化三铁复合纳米粒子诱导人干细胞定向分化用于中枢神经损伤修复及实时MRI造影的方法报道。
技术实现思路
本专利技术设计了一Gd:Fe3O4@RA纳米粒子诱导神经干细胞定向分化为神经元细胞的方法，其解决的技术问题是现有技术中尚未见经多功能钆参杂四氧化三铁复合纳米粒子诱导人干细胞定向分化用于中枢神经损伤修复及实时MRI造影的方法。为了解决上述存在的技术问题，本专利技术采用了以下方案：一种Gd:Fe3O4@RA纳米粒子诱导神经干细胞定向分化为神经元细胞的实验方法，包括以下步骤：在培养板中放入预先用多聚赖氨酸处理的盖玻片，将来源于大鼠胚胎脑海马的原代和传代神经干细胞以1×107L-1分别接种到培养孔中，神经干细胞完全培养液中去除碱性成纤维细胞生长因子，并添加1.0ml,浓度为1mg/ml的Gd:Fe3O4@RA复合纳米离子和体积分数为5％的胎牛血清促进神经干细胞分化，培养6天后，继续在含有体积分数为5％胎牛血清的神经干细胞培养基中培养6天，待细胞形态发育成熟后取出盖玻片；将载有常规贴壁分化培养和Gd:Fe3O4@RA复合纳米离子诱导分化培养的细胞的盖玻片各分为2组，分别神经元标志物标记的β-微管蛋白(TUJ1)的免疫组化；随机选取N张片子作为样本，每个样本系统随机取N个视野，N为自然数，以荧光标记为阳性，按照下列公式计算出各个片子神经干细胞分化为神经元细胞的百分率：神经元细胞百分率＝(荧光标记阳性细胞数/细胞总数)×100％；将Gd:Fe3O4@RA复合纳米离子分化培养的神经干细胞与常规贴壁分化培养的神经干细胞比较。进一步，所述Gd:Fe3O4@RA复合纳米离子制备方法如下：首先、将1.88g苯甲酸钠溶液加入100ml蒸馏水中，然后加入含有0.5gFeCl2.4H2O和0.46gGdCl3.2H2O的水溶液中，将25毫升乙腈加入到该溶液中；反应混合物在室温下搅拌至少12小时，得到浅棕色沉淀物；该浅棕色沉淀物为Fe/Gd单源前驱体,经过滤后用乙醚洗涤,真空泵干燥，获得Fe/Gd干燥前驱体；其次、接下来将0.2g制备的Fe/Gd干燥前驱体加入含有油胺、油酸和苄醚的反应混合物中，比例为体积比为4.5ml∶3ml∶2.5ml，然后在氮气流下加热到110℃保持30分钟，然后温度缓慢加热到350℃保持30分钟得到黑色/棕色物质；冷却至室温后分离，加入至少10ml的乙醇，通过洗涤和再分离，得到的黑色/棕色的Gd:Fe3O4纳米粒子，最后在真空干燥，将得到直径为7-10纳米的Gd:Fe3O4纳米粒子；再次、将0.02克Gd:Fe3O4纳米粒子加入到含有0.1g活性聚合物邻羟基苯-PEG-羧基端化合物(平均分子量为4000)的10毫升CHCl3中；然后将混合物在室温下在黑暗中搅拌12小时；加入20ml正己烷，离心沉淀得到表面功能化的Gd掺杂四氧化三铁纳米粒子Gd:Fe3O4@DIB-PEG-COOH(邻羟基苯-PEG-羧基端化合物)，经10mlCHCl3和正己烷(1:5v/v)洗涤后，分散于5ml蒸馏水中，用蒸馏水透析24小时，除去未反应的有机分子，并储存于黑暗中；从次、利用酸催化的酯键制备将载有维甲酸的环糊精与纳米粒子表面的羧基进行相连，从而完成制备Gd:Fe3O4@RA：将1ml的HCl溶液(浓度为：1mol/L)与1mlGd:Fe3O4@DIB-PEG-COOH(邻羟基苯-PEG-羧基端化合物)溶液混合搅拌30分钟，然后加入0.05g维甲酸-β-环糊精包合物(分子比维甲酸：β-环糊精＝6:1),搅拌均匀后，混合物保持在黑暗中以及80℃，并在旋转摇动器上以15-30rpm/min速度搅拌，并反应至少12小时；最后，通过丙烯葡聚糖凝胶色谱柱进行分离，从而得到负载维甲酸的钆参杂四氧化三铁复合纳米粒子Gd:Fe3O4@RA，冻干保存。一种用于诱导干细胞定向分化及用于实时MRI造影的多功能钆参杂四氧化三铁复合纳米粒子，其中，钆参杂四氧化三铁为MRI造影剂及纳米载体，其负载的维甲酸为活性成分，其本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种Gd:Fe3O4@RA纳米粒子诱导神经干细胞定向分化为神经元细胞的实验方法，包括以下步骤：在培养板中放入预先用多聚赖氨酸处理的盖玻片，将来源于大鼠胚胎脑海马的原代和传代神经干细胞以1×107L‑1分别接种到培养孔中，神经干细胞完全培养液中去除碱性成纤维细胞生长因子，并添加1.0ml,浓度为1mg/ml的Gd:Fe3O4@RA复合纳米离子和体积分数为5％的胎牛血清促进神经干细胞分化，培养6天后，继续在含有体积分数为5％胎牛血清的神经干细胞培养基中培养6天，待细胞形态发育成熟后取出盖玻片；将载有常规贴壁分化培养和Gd:Fe3O4@RA复合纳米离子诱导分化培养的细胞的盖玻片各分为2组，分别神经元标志物标记的β‑微管蛋白(TUJ1)的免疫组化；随机选取N张片子作为样本，每个样本系统随机取N个视野，N为自然数，以荧光标记为阳性，按照下列公式计算出各个片子神经干细胞分化为神经元细胞的百分率：神经元细胞百分率＝(荧光标记阳性细胞数/细胞总数)×100％；将Gd:Fe3O4@RA复合纳米离子分化培养的神经干细胞与常规贴壁分化培养的神经干细胞比较。

【技术特征摘要】
1.一种Gd:Fe3O4@RA纳米粒子诱导神经干细胞定向分化为神经元细胞的实验方法，包括以下步骤：在培养板中放入预先用多聚赖氨酸处理的盖玻片，将来源于大鼠胚胎脑海马的原代和传代神经干细胞以1×107L-1分别接种到培养孔中，神经干细胞完全培养液中去除碱性成纤维细胞生长因子，并添加1.0ml,浓度为1mg/ml的Gd:Fe3O4@RA复合纳米离子和体积分数为5％的胎牛血清促进神经干细胞分化，培养6天后，继续在含有体积分数为5％胎牛血清的神经干细胞培养基中培养6天，待细胞形态发育成熟后取出盖玻片；将载有常规贴壁分化培养和Gd:Fe3O4@RA复合纳米离子诱导分化培养的细胞的盖玻片各分为2组，分别神经元标志物标记的β-微管蛋白(TUJ1)的免疫组化；随机选取N张片子作为样本，每个样本系统随机取N个视野，N为自然数，以荧光标记为阳性，按照下列公式计算出各个片子神经干细胞分化为神经元细胞的百分率：神经元细胞百分率＝(荧光标记阳性细胞数/细胞总数)×100％；将Gd:Fe3O4@RA复合纳米离子分化培养的神经干细胞与常规贴壁分化培养的神经干细胞比较。2.根据权利要求1所述的Gd:Fe3O4@RA纳米粒子诱导神经干细胞定向分化为神经元细胞的实验方法，其特征在于：所述Gd:Fe3O4@RA复合纳米离子制备方法如下：首先、将1.88g苯甲酸钠溶液加入100ml蒸馏水中，然后加入含有0.5gFeCl2.4H2O和0.46gGdCl3.2H2O的水溶液中，将25毫升乙腈加入到该溶液中；反应混合物在室温下搅拌至少12小时，得到浅棕色沉淀物；该浅棕色沉淀物为Fe/Gd单源前驱体,经过滤后用乙醚洗涤,真空泵干燥，获得Fe/Gd干燥前驱体；其次、接下...

【专利技术属性】
技术研发人员：王冠男，金丽，代晨，谭文彬，
申请(专利权)人：济宁医学院，
类型：发明
国别省市：山东,37