一种高纯度透明质酸寡糖的制备方法技术

本发明专利技术提供一种高纯度透明质酸寡糖的制备方法，以透明质酸酶水解透明质酸得到透明质酸寡糖混合物；使用离子交换色谱柱对透明质酸寡糖混合物进行分离、脱盐，本发明专利技术采用的填料粒径小、流速高、柱长短，可明显缩短分离时间，使分离效率大大提高，可实现克级寡糖的生产，易于向更大生产规模转化。

【技术实现步骤摘要】
一种高纯度透明质酸寡糖的制备方法
本专利技术涉及透明质酸寡糖的制备领域，具体涉及一种高纯度透明质酸寡糖的制备方法。
技术介绍
透明质酸(Hyaluronicacid，简称HA)又名玻璃酸，是由(1-3)-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖(1-4)-D-D-葡萄醛酸双糖重复单位所组成的高分子量的直链粘多糖。1934年由Meyer等人从牛玻璃球眼中首次提取获得。分子量大小对HA的生物活性影响较大，不同分子量范围的HA表现出截然不同的生理学功能。高分子量的HA(Mr>1×106)由于具有较好的粘弹性、保湿性、抑制炎性反应、润滑等功能，可应用于高端化妆品行业、眼科手术黏弹剂和关节腔内注射治疗。中等分子量的HA(介于1×105-106)具有良好的保湿性、润滑和药物缓释作用，可广泛用于化妆品、滴眼液、皮肤烧伤愈合及术后防粘连。低分子量的HA和寡聚透明质酸，表现出非常强的生物活性，具有抑制肿瘤扩散、促进创伤愈合、促进骨和血管生成、免疫调节等作用，且易于渗透到真皮中，免疫细胞、细胞因子的激活剂。因此，小分子透明质酸在食品保健、化妆品以及临床医疗领域具有广阔的应用前景。透明质酸经过酶解得到的产物一般为多种透明质酸寡糖(oligosaccharidesofhyaluronan，简称o-HA)的混合物，如果要制备不同糖残基数的o-HA，必须经过分离。o-HA是相对分子量小于10000、单糖残基数量为2～40(一般为4～16)的HA分子片段。o-HA属于小分子多糖，其性质与普通HA有很大不同，甚至具有完全相反的作用。目前透明质酸寡糖主要通过柱色谱法进行分离纯化。由于透明质酸本身结构特点，分离方法主要有凝胶色谱法和离子交换色谱法。凝胶色谱法主要根据各寡糖分子量的不同进行分离。凝胶色谱所用填料都有一定排阻极限，而高分子量寡糖之间相对分子量差异较小，使其较难分离；另外对于相对低分子量的寡糖分离则仍需要较长色谱柱尺寸，较低的流速，显然不利于大规模制备。离子交换色谱法主要根据寡糖所带羧基电荷的不同进行分离，分子量越高，所带羧基电荷越多，与填料结合能力越强，越难洗脱。在专利文献1中公开了一种利用离子交换柱实现单一分子量透明质酸寡糖的制备方法，其中使用强阴离子交换柱HiPrepQFF16/10对透明质酸酶水解透明质酸得到的透明质酸寡糖混合物进行分离纯化。得到的寡糖HA4、HA6、HA8、HA10、HA12、HA14的产物纯度分别为75％、64.5％、55％、43.5％、43％、40.5％，HA4、HA6、HA8、HA10、HA12、HA14的产物得率分别为94％、91％、88％、87.5％、85％、82％、80.5％。现有技术文献专利文献专利文献1:CN106399428A
技术实现思路
然而，上述专利文献1中以2mL/min的流速进行洗脱，分离时间仍旧较长，并不适于向更大生产规模的转化，另外，仍旧有透明质酸寡糖的纯度提高以及种类扩大的余地。为了解决上述技术问题，本专利技术专利采用的技术方案是：1.一种高纯度透明质酸寡糖的制备方法，其特征在于，包括：透明质酸酶解步骤，以透明质酸酶水解透明质酸得到透明质酸寡糖混合物；透明质酸寡糖的分离步骤，使用离子交换色谱柱对透明质酸寡糖混合物进行分离，根据出峰时间依次收集各组分；和透明质酸寡糖的脱盐步骤，将分离后的各组分通过旋蒸浓缩，然后用尺寸排阻色谱进行脱盐，其中，在所述透明质酸寡糖的分离的步骤中，所述离子交换色谱柱为强阴离子交换色谱柱。2.根据项1所述的制备方法，其还包括在所述透明质酸寡糖的脱盐步骤之后，针对脱盐后的各组分依次进行旋蒸浓缩，以及放入冻干机冻干的冻干步骤。3.根据项2所述的制备方法，其还包括在所述冻干步骤之后，将冻干后的各组分，依次用高效液相色谱法进行分析，用面积归一化法测定各组分的纯度的检测步骤。4.根据项1～3中任一项所述的制备方法，其中，所述透明质酸寡糖的分离步骤中的所述离子交换色谱柱在0～5000psi的压力下使用，且其固定相为键合季铵强阴离子交换基团的硅胶固定相。5.根据项1～4中任一项所述的制备方法，其中，所述透明质酸寡糖的分离步骤中的所述离子交换色谱柱为SepaxHP-SAX。6.根据项1～5中任一项所述的制备方法，其中，所述透明质酸寡糖的脱盐中使用的是尺寸排阻色谱是HW-40F或SephadexG10。7.根据项3～6中任一项所述的制备方法，其中，所述检测步骤中使用的色谱柱为LUNANH2柱。8.根据项1～7中任一项所述的制备方法，其中，所述透明质酸寡糖的分离步骤中的所述离子交换色谱柱使用的流动相为0～0.5mol/LNaCl或Na2SO4溶液的线性梯度洗脱。9.根据项1～8中任一项所述的制备方法，其中，所述透明质酸寡糖的分离步骤中的离子交换色谱柱中流动相的流速为5～100ml/min，优选为20～80ml/min，进一步优选为30～60ml/min。10.根据项1～9中任一项所述的制备方法，其中，所述透明质酸寡糖的分离步骤中的离子交换色谱柱中流动相的运行时间为30min以上，优选为30～600min，更优选为40～150min，进一步优选为50～100min。11.根据项3～10中任一项所述的制备方法，其中，利用高效液相色谱法分析得到的HA4～HA20的纯度在80％以上，总收率在50％以上。专利技术的效果本专利技术的方法可提供的o-HA的种类更为丰富。可生产HA4～HA20的透明质酸寡糖。且与现有技术相比，生产的o-HA纯度较高，HA4,HA6,HA8，HA10纯度>95.0％，HA12,HA14,HA16，HA18，HA20纯度>85.0％，总收率能达到60％以上。本专利技术的方法与现有技术相比，采用更小粒径的填料、更高的流速、更短的柱长，可明显缩短分离时间，使分离效率大大提高。并且本专利技术的方法可实现克级寡糖的生产，易于向更大生产规模转化。附图说明图1为实施例1中的o-HA制备的色谱图。专利技术的具体实施方式以下将对本专利技术做以详细说明。根据本专利技术的一个方面，提供一种高纯度透明质酸寡糖的制备方法，其特征在于，包括：透明质酸酶解步骤，以透明质酸酶水解透明质酸得到透明质酸寡糖混合物；透明质酸寡糖的分离步骤，使用离子交换色谱柱对透明质酸寡糖混合物进行分离，根据出峰时间依次收集各组分；和透明质酸寡糖的脱盐步骤，将分离后的各组分，通过旋蒸浓缩，依次用尺寸排阻色谱进行脱盐，其中，在上述透明质酸寡糖的分离的步骤中，上述离子交换色谱柱为0～5000psi的压力下使用的强阴离子交换色谱柱。在本专利技术的一个实施方式中，本专利技术的制备方法还包括在上述透明质酸寡糖的脱盐步骤之后，将脱盐后的各组分，依次进行浓缩，放入冻干机冻干的冻干步骤。在本专利技术的一个实施方式中，本专利技术的制备方法还包括在上述透明质酸寡糖的脱盐步骤之后，将冻干后的各组分，依次用高效液相色谱法进行分析，面积归一化法测定各组分的纯度的检测步骤。下面具体说明本专利技术的高纯度透明质酸寡糖的制备方法中的各个步骤。1.透明质酸酶解步骤本专利技术的透明质酸酶解步骤是以透明质酸酶水解透明质酸得到透明质酸寡糖混合物的步骤。本文中的术语“酶解”，是利用活性酶来水解特定的某种物质，这种方法可用于一般的生物实验中，酶(enzyme)是由活细胞产生的、对其底物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高纯度透明质酸寡糖的制备方法，包括：透明质酸酶解步骤，以透明质酸酶水解透明质酸得到透明质酸寡糖混合物；透明质酸寡糖的分离步骤，使用离子交换色谱柱对透明质酸寡糖混合物进行分离，根据出峰时间依次收集各组分；透明质酸寡糖的脱盐步骤，将分离后的各组分通过旋蒸浓缩，然后用尺寸排阻色谱进行脱盐，其中，在所述透明质酸寡糖的分离的步骤中，所述离子交换色谱柱为强阴离子交换色谱柱。

【技术特征摘要】
1.一种高纯度透明质酸寡糖的制备方法，包括：透明质酸酶解步骤，以透明质酸酶水解透明质酸得到透明质酸寡糖混合物；透明质酸寡糖的分离步骤，使用离子交换色谱柱对透明质酸寡糖混合物进行分离，根据出峰时间依次收集各组分；透明质酸寡糖的脱盐步骤，将分离后的各组分通过旋蒸浓缩，然后用尺寸排阻色谱进行脱盐，其中，在所述透明质酸寡糖的分离的步骤中，所述离子交换色谱柱为强阴离子交换色谱柱。2.根据权利要求1所述的制备方法，其还包括：在所述透明质酸寡糖的脱盐步骤之后，针对脱盐后的各组分依次进行旋蒸浓缩、以及放入冻干机冻干的步骤。3.根据权利要求2所述的制备方法，其还包括：在所述冻干步骤之后，将冻干后的各组分，依次用高效液相色谱法进行分析，用面积归一化法测定各组分的纯度的检测步骤。4.根据权利要求1～3任一项所述的制备方法，其中，所述透明质酸寡糖的分离步骤中的所述离子交换色谱柱在0～5000psi的压力下使用，且其固定相为键合季铵强阴离子交换基团的硅胶固定相，优选所述离子交换色谱柱为SepaxHP-SAX。5.根据权利要求1～4中任一项所述的制...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈玉娟，陈雯雯，杜国辉，刘建建，李德杰，穆淑娥，郭学平，栾贻宏，
申请(专利权)人：华熙福瑞达生物医药有限公司，山东华熙海御生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37