评价母乳性黄疸的生物标志物、试剂盒以及方法技术

本发明专利技术公开了一种评价母乳性黄疸的生物标志物，所述生物标志物为肠道菌群，例如埃希氏菌、罗斯氏菌的一种或多种。本发明专利技术还公开了一种评价母乳性黄疸的检测试剂盒以及评价母乳性黄疸的方法，所述检测试剂盒包括粪便基因组样本提取试剂和16S rRNA基因的PCR扩增试剂。本发明专利技术通过肠道菌群作为生物标志物，能够容易且可靠地检测母乳性黄疸，为临床上母乳性黄疸的早期诊断提供了可能，从而有利于降低因诊断暂停母乳喂养的风险及因严重母乳性黄疸导致的核黄疸。

Biomarkers, kits and methods for evaluating breast milk jaundice

The invention discloses a biomarker for evaluating breast milk jaundice, which is one or more intestinal flora, such as Escherichia coli and Rosella. The invention also discloses a test kit for evaluating breast milk jaundice and a method for evaluating breast milk jaundice. The test kit includes a stool genome sample extraction kit and a 16S rRNA gene PCR amplification kit. By using intestinal flora as a biomarker, the invention can easily and reliably detect breast-milk jaundice, which provides a possibility for early diagnosis of breast-milk jaundice in clinic, thereby reducing the risk of suspension of breast-feeding due to diagnosis and nuclear jaundice due to severe breast-milk jaundice.

【技术实现步骤摘要】
评价母乳性黄疸的生物标志物、试剂盒以及方法
本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种用于评价母乳性黄疸的生物标志物、试剂盒以及方法。
技术介绍
新生儿期胆红素生成较多、肝脏摄取胆红素能力低下、肠肝循环存在，导致出生后血清胆红素水平呈现动态变化，出生1～2周内常会出现一过性黄疸，其中大部分属于生理性黄疸，但在围生期感染、同族免疫性溶血、母乳喂养、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏等特殊疾病状态下可致病理性黄疸。与其他病理性黄疸相比，母乳性黄疸无特有的临床表现，且发病机制尚不明确，缺乏诊断黄疸病因的生物学标记物，目前用于母乳性黄疸的诊断主要为排他性诊断，包括(1)纯母乳喂养；(2)黄疸在出生后4～28天内出现并持续不退，血清胆红素以未结合胆红素增高为主；(3)停母乳3天，黄疸明显减轻，胆红素降至原来水平的50％及以上；(4)排除感染、G-6P-D缺乏、自身免疫性溶血、红细胞增多症、头皮血肿、颅内出血、胆汁淤积、低血糖、甲减、低体温、窒息等其他病理性黄疸原因。过高的胆红素水平可发生胆红素脑病或核黄疸，遗留听力、视力损害以及神经系统损伤；母乳性黄疸由母乳因素引起，常常通过试停母乳观察黄疸消退情况进行诊断，极易导致母乳喂养中断或提前终止。随着对肠道微生物认识的深入研究，人们对肠道微生物在人体的作用越来越清晰，对肠道微生物与人类的健康疾病的关系也有了更深层次的认识。16SrRNA高通量测序技术是根据细菌的保守序列设计扩增引物，通过PCR扩增将所有含有保守序列的微生物片段进行扩增、捕获，再根据细菌的变异序列(即每种细菌所特有的序列)进行测序分析及比对，以确定细菌的种属信息。相对传统的细菌培养或普通PCR分子生物学技术而言，16SrRNA高通量测序具有高准确性、高灵敏度，能获得较为全面的微生物信息。肠道细菌参与胆红素代谢，其组成与血清胆红素水平关系密切，母乳性黄疸患儿缺乏转化胆红素的肠道菌群可能导致胆红素肠肝循环增加，引起新生儿高胆红素血症。目前对母乳性黄疸发病机制的认识尚不足，临床诊断缺乏实验室诊断指标，不易与其他病因相鉴别而主要依赖排他性诊断，因此，新的可以用来诊断和识别母乳性黄疸的生物学标记物亟待发现。
技术实现思路
本申请人经研究发现母乳性黄疸患儿肠道菌群结构存在改变，虽然引起母乳性黄疸肠道菌群变化的机制仍不清楚，但肠道菌群结构的改变可以预示母乳性黄疸的发生发展并为母乳性黄疸的诊断提供可靠证据。因此，通过检测可疑母乳性黄疸患者肠道菌群的结构，可以明确该患者是否为母乳性黄疸，而不再单纯依赖排他性诊断，亦能降低因诊断导致母乳喂养暂停的风险。由于肠道菌群对胆红素代谢的影响是黄疸发生发展的关键环节之一，对肠道菌群结构进行全面、完整的检测对依据肠道菌群实现母乳性黄疸早期诊断十分重要。目前采用的肠道菌群结构分析检测方法主要为16SrRNA高通量测序，可对肠道菌群信息实现较全面的分析，本专利技术针对现有技术中母乳性黄疸诊断缺乏高敏感性和特异性生物标记物的问题，目的在于提供一组母乳性黄疸的生物标志物，该生物标志物即为埃希氏菌、罗斯氏菌。本专利技术的目的之一在于提供一种评价母乳性黄疸的生物标志物，所述生物标志物为肠道菌群。所述肠道菌群为埃希氏菌、罗斯氏菌、或者为埃希氏菌和罗斯氏菌；若粪便中，所述埃希氏菌的截断值为0.027，和/或，所述罗斯氏菌的截断值为0.012。若粪便中，所述埃希氏菌的丰度大于截断值0.027，和/或，所述罗斯氏菌的丰度大于截断值0.012，则辅助诊断为母乳性黄疸。所述评价包括鉴定、辅助诊断或预测。本专利技术的目的之二在于提供一种评价母乳性黄疸的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括粪便样本基因组提取试剂和16SrRNA基因的PCR扩增试剂。所述检测试剂盒还包括PCR产物混合纯化试剂，例如纯化试剂为结合液、清洗液和洗脱液。所述粪便样本基因组提取试剂包括QIAamp粪便DNA快速提取试剂盒，也即QIAampFastDNAStoolMiniKit(51604)试剂盒，具体成分为InhibitExBuffer、蛋白酶K、BufferAL、BufferAW1、BufferAW2、BufferAE。还可以包括乙醇(浓度为96％～100％)。所述16SrRNA基因的PCR扩增试剂包括16SrDNA上游引物和下游引物、dNTP、DNA聚合酶、Mg2+、灭菌蒸馏水和含SYB荧光绿(SYBgreen)的上样缓冲液。本专利技术的目的之二在于提供一种用本专利技术的评价母乳性黄疸的检测试剂盒评价母乳性黄疸的方法，所述方法包括：步骤S1，利用权利要求6所述的检测试剂盒中的粪便样本基因组提取试剂提取粪便中的基因组；步骤S2，以步骤S1提取到的基因组作为模板，利用权利要求6所述的检测试剂盒中的16SrRNA基因的PCR扩增试剂进行PCR扩增；步骤S3，根据PCR扩增产物分析肠道菌群在粪便中的丰度，来辅助诊断母乳性黄疸；若粪便中，所述埃希氏菌的丰度大于截断值0.027，和/或，所述罗斯氏菌的丰度大于截断值0.012，则辅助诊断为母乳性黄疸。此处丰度根据ROC曲线求得各生物标志物的截断值，取灵敏度和特异度均较高的点作为截断值，埃希氏菌、罗斯氏菌的截断值分别为0.027和0.012，高于此数值诊断为母乳性黄疸阳性，否则为阴性。在步骤S2中，PCR扩增条件为：热循环由98℃初始变形1分钟，然后再98℃变性10秒，在50℃退火30秒和72℃延伸30秒，进行30次循环变性，最后72℃5分钟。在本专利技术中，埃希氏菌(Escherichia)是细菌界，变形菌门，Γ-变形菌纲，肠杆菌目，肠杆菌科；其菌种是有动力、不形成芽孢的革兰阴性杆菌；能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常定植菌。在本专利技术中，罗斯氏菌(Rothia)是细菌界，放线菌门，放线菌纲，放线菌目，微球菌科；不产芽孢，运动活跃，在细胞的凹面的近端处或一端生有一簇鞭毛。发酵几种碳水化合物，包括木糖、半乳糖、棉子糖、葡萄糖、麦芽糖、纤维二糖、蔗糖、淀粉和糖原，主要产生或只产生丁酸。本专利技术的积极进步效果在于：本专利技术人研究发现肠道微生物群在母乳性黄疸发生中起着关键作用，并发现埃希氏菌、罗斯氏菌可以有效作为母乳性黄疸的生物标志物和治疗靶点，通过该生物标志物能够容易且可靠地检测母乳性黄疸。例如，通过测定母乳性黄疸患者粪便中所含有的埃希氏菌、罗斯氏菌相对丰度的水平，就能比较容易判定是否患有母乳性黄疸，受试者工作曲线下面积(AUC)均在75％以上；联合应用时，AUC比单个更接近1，预测效果更好。本专利技术通过该标志物能够容易且可靠地检测母乳性黄疸，为临床上母乳性黄疸的早期诊断提供了可能，从而有利于降低因诊断暂停母乳喂养的风险及因严重母乳性黄疸导致的核黄疸。以下将结合附图对本专利技术的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本专利技术的目的、特征和效果。附图说明图1A和图1B分别为采用观察物种指数和香农指数指标比较对照组新生儿和母乳性黄疸患儿试验组肠道微生物群多样性的比较图，其中，观察物种指数和香农指数均为评价α多样性的指标；统计学方法为曼-惠特尼秩和检验，ns为差异无统计学意义，说明α多样性指数不适合用作诊断标记物。图2A和2B为16SrRNA测序对照组新生儿和母乳性黄疸患儿试验组肠道中埃希氏菌、罗斯氏菌相对丰度水平的比较图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种评价母乳性黄疸的生物标志物，其特征在于所述生物标志物为肠道菌群。

【技术特征摘要】
1.一种评价母乳性黄疸的生物标志物，其特征在于所述生物标志物为肠道菌群。2.如权利要求1所述的评价母乳性黄疸的生物标志物，其特征在于，所述肠道菌群为埃希氏菌，所述埃希氏菌的截断值为0.027。3.如权利要求1所述的评价母乳性黄疸的生物标志物，其特征在于，所述肠道菌群为罗斯氏菌，所述罗斯氏菌的截断值为0.012。4.如权利要求1所述的评价母乳性黄疸的生物标志物，其特征在于，所述肠道菌群为埃希氏菌和罗斯氏菌，所述埃希氏菌的截断值为0.027，所述罗斯氏菌的截断值为0.012。5.如权利要求1所述的评价母乳性黄疸的生物标志物，其特征在于，所述评价包括鉴定、辅助诊断或预测。6.一种评价母乳性黄疸的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包括粪便样本基因组提取试剂和16SrRNA基因的PCR扩增试剂。7.如权利要求6所述的评价母乳性黄疸的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒还包括PCR产物混合纯化试剂。8.如权利要求6所述的评价...

【专利技术属性】
技术研发人员：李菁，莫茜，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心，
类型：发明
国别省市：上海,31