一种用于miRNA检测的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种用于miRNA检测的试剂盒及其应用，所述试剂盒包括miRNA检测引物、DNA聚合酶、切刻内切酶和数字微流控芯片。该试剂盒基于数字微流控芯片和等温扩增技术开发，具有较高的检测灵敏度、特异性和准确性；同时，具有较强的通用性，只需根据不同的miRNA的特异性序列，设计引物的特异性碱基序列，即可实现所有miRNA的检测。本发明专利技术的试剂盒无需对人类体液样品进行复杂的预处理和RNA提取、逆转录等，直接对体液中游离的、微量的miRNA进行检测，且不受其它相似miRNA序列的干扰，可以实现miRNA的绝对定量，具有操作简单、检测设备要求低、成本低廉等优势，适于广泛推广应用。

A Kit for Detecting MicroRNA and Its Application

The invention provides a kit for the detection of microRNA and its application. The kit includes microRNA detection primers, DNA polymerase, endonuclease and digital microfluidic chip. The kit is based on digital microfluidic chip and isothermal amplification technology, and has high detection sensitivity, specificity and accuracy. At the same time, it has strong versatility. It can detect all microRNAs by designing specific base sequences of primers according to different specific sequences of microRNAs. The kit of the invention does not need complex pretreatment of human body fluid samples, RNA extraction, reverse transcription, etc. It directly detects free and trace microRNAs in body fluid, and is not interfered by other similar microRNAs sequence. It can realize the absolute quantification of microRNAs, and has the advantages of simple operation, low detection equipment requirements, low cost, etc., and is suitable for wide application.

【技术实现步骤摘要】
一种用于miRNA检测的试剂盒及其应用
本专利技术涉及医学检测和分子生物学
，具体涉及一种用于miRNA检测的试剂盒及其应用。
技术介绍
微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一类在多种真核细胞和病毒中发现的内源性非编码单链RNA，长度约为18-24个核苷酸，进化上具有较高的保守性。miRNA不编码蛋白质，但可在转录后调控基因表达，影响蛋白质的翻译。研究表明，一种miRNA可以调控一个或多个基因的表达，多种miRNA也可以共同调控同一基因，使其翻译中断，阻止相应蛋白质的合成，进而实现对细胞功能的调控。基于这种调控功能，miRNA在细胞发育、凋亡、分化、增殖等重要的生理病理过程中发挥重要作用。研究发现，人的体液如血液、尿液、唾液、羊水、胸腹水等都分布大量的miRNA分子，这些miRNA的基因表达水平与组织细胞中呈现相同的规律，且大量的研究证明miRNA的表达与多种疾病，如癌症、心血管疾病等密切相关，正逐渐成为疾病早期筛查与预后诊断的新型生物标志物。近年来，研究人员开始广泛关注循环游离miRNA的研究，有研究表明这些游离的miRNAs是起源于循环肿瘤细胞，并释放到各种生物流体中。由于这些游离的miRNAs生成速度快，可以被较早地发现与检测，对于疾病，特别是肿瘤的早期监测具有很大价值。另外，研究也表明，循环游离的miRNA可以稳定的存在于生物流体，如血清、尿液中，但是，如果脱离人体体液环境存在，就很容易降解。因此，对于循环游离miRNA的定量检测，采用不对体液样本进行预处理，而是直接检测的方式最为合适。近年来，已有多个循环miRNAs被发现可以用于作为癌症的生物标志物。例如，研究发现miR-1在胃癌和肺癌患者的血清中被上调，而在肝癌、和膀胱癌患者的血清中的表达量相对较低；miR-10b在乳腺癌和前列腺癌血液中的含量中较高，而在结直肠癌的血液中被下调；其它还包括miR-21、miR24、miR-29a、miR-122、miR-181a等都是与癌症相关、且被广泛认可的生物标志物。其中，在慢性肾病研究方面，研究表明，患者尿液中miRNA-181a基因的表达水平要比健康人低200倍，同样的结果也在慢性肾病患者的血清中得到验证，低浓度miRNA的检测对检测试剂的灵敏度提出了很高的要求，传统的检测试剂盒和方法已经不能满足样本中这种极低浓度miRNA的检测要求。因此，开发检测灵敏度更高的miRNA检测试剂盒具有重要意义。等温扩增(Isothermalamplificationtechnology)是一种核酸体外扩增技术，其反应过程始终维持在恒定的温度下进行，通过添加不同活性、不同功能的酶，以及相应特异性引物来实现核酸的快速扩增目的。链置换扩增术(Stranddisplacementamplification，SDA)是近几年新发展的一种等温扩增方法。通过限制性核酸内切酶识别特定的靶序列，将链DNA打开缺口，DNA聚合酶继之延伸缺口3’端并替换下一条DNA链。被替换下来的DNA单链可与引物结合并被DNA聚合酶延伸成双链。该过程不断反复进行，使靶序列高效扩增。整个扩增过程克服了传统聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction，PCR)需要通过反复变性获得单链模板的缺点；降低了反复升降温对检测平台的硬件要求；实现了恒温条件下的连续、快速扩增；同时还兼具更高的检测灵敏度和扩增效率。
技术实现思路
为解决现有技术中的问题，本专利技术的目的在于提供一种用于miRNA检测的试剂盒及其应用。首先，本专利技术提供一种用于miRNA检测的试剂盒，所述试剂盒包括miRNA检测引物、反应酶系和数字微流控芯片；所述反应酶系包括DNA聚合酶和切刻内切酶。本专利技术中，所述miRNA检测引物包括：SEQIDNO.1：5’-CGGATCCTCTNNNNNNNNNNNN-3’；SEQIDNO.2：5’-CGGATCGTCTNNNNNNNNNNNN-3’；所述检测引物的碱基序列包括能够结合所有miRNA的通用碱基序列以及能够结合特定miRNA的特异性碱基序列，其中，N为能够与特定的miRNA特异结合的碱基。本专利技术提供的miRNA检测试剂盒为miRNA检测的通用试剂盒，在进行不同的miRNA检测时，仅需根据特定的miRNA的序列，将如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的引物的N碱基替换为与特定miRNA特异结合的碱基序列即可。本专利技术以miRNA-181a作为示例性说明：当所述miRNA为miRNA-181a时，所述检测引物包括：SEQIDNO.3：5’-CGGATCCTCTACTCACCGACAG-3’；SEQIDNO.4：5’-CGGATCGTCTAACATTCAACGC-3’。本专利技术中，所述切刻内切酶为Nt.AlwI；所述DNA聚合酶为具有3’-5’外切酶活性的Klenowfragment。为实现更好的检测效果，本专利技术所述的数字微流控芯片为以聚二甲基硅氧烷为材料制备得到。具有优越性能的数字微流控芯片能够实现更好的检测效果，优选地，本专利技术中，所述数字微流控芯片由包括聚二甲基硅氧烷、固化剂和表面活性剂的原料制备得到，所述原料中聚二甲基硅氧烷、固化剂和表面活性剂的质量比为10：1：0.002；所述表面活性剂为TritonX-100、吐温80、2-吗啉乙磺酸中的一种或多种。更优选地，所述表面活性剂为TritonX-100。上述数字微流控芯片可采用本领域常用的制备方法制备得到，优选地，所述数字微流控芯片为将聚二甲基硅氧烷、固化剂和表面活性剂混合后，经80℃烘烤2～4h，脱模制备得到。为满足检测通量需要和芯片制备需要，作为本专利技术的一种优选实施方式，所述数字微流控芯片模具含有8个检测通道，每个检测通道含有7520个微反应室；所述模具中8个检测通道中加样孔的间距为8.95mm。上述数字微流控芯片模具可采用本领域常用的模具制备方法制备得到。为满足检测需要，本专利技术中，所述试剂盒还包括反应缓冲液，所述反应缓冲液包括如下组分：Mg2+、BSA、荧光染料和dNTPs；所述荧光染料为EvaGreen、LCGreen、SYTO9的一种；优选地，所述荧光染料为EvaGreen；更优选地，所述反应缓冲液包括如下组分：NaCl、Tris-HCl、MgCl2，BSA、EvaGreen和dNTPs。作为本专利技术的一种实施方式，所述反应缓冲液包括如下组分：50mMNaCl、10mMTris-HCl、10mMMgCl2，100μg/mLBSA、20×Evagreen和2.5mMdNTPs。本专利技术中，所述试剂盒还包括用于密封数字微流控芯片的反应腔的密封液和用于稀释样本的稀释液。具体地，所述密封液为FC40、Novec7500、石蜡油、矿物油中的一种或多种，优选为矿物油；所述稀释液为水、NaCl溶液、PBS缓冲液中的一种或多种，优选为0.9％的NaCl溶液。进一步地，本专利技术还提供所述miRNA检测试剂盒在检测miRNA含量中的应用。优选地，所述应用为检测人类体液中miRNA的含量。所述体液包括但不限于尿液、血清、血浆、唾液、脑脊液。所述miRNA包括但不限于miRNA181a、miRNA-21、miRNA-141、miRNA29a、miRNA-29c、miRNA-133本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于miRNA检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括miRNA检测引物、反应酶系和数字微流控芯片；所述反应酶系包括DNA聚合酶和切刻内切酶。

【技术特征摘要】
1.一种用于miRNA检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括miRNA检测引物、反应酶系和数字微流控芯片；所述反应酶系包括DNA聚合酶和切刻内切酶。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述miRNA检测引物包括：SEQIDNO.1：5’-CGGATCCTCTNNNNNNNNNNNN-3’；SEQIDNO.2：5’-CGGATCGTCTNNNNNNNNNNNN-3’；所述检测引物的碱基序列包括能够结合所有miRNA的通用碱基序列以及能够结合特定miRNA的特异性碱基序列，其中，N为能够与特定的miRNA特异结合的碱基。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，当所述miRNA为miRNA-181a时，所述检测引物包括：SEQIDNO.3：5’-CGGATCCTCTACTCACCGACAG-3’；SEQIDNO.4：5’-CGGATCGTCTAACATTCAACGC-3’。4.根据权利要求1～3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述切刻内切酶为Nt.AlwI；所述DNA聚合酶为具有3’-5’外切酶活性的Klenowfragment。5.根据权利要求1～4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述数字微流控芯片为以聚二甲基硅氧烷为材料制备得到；优选地，所述数字微流控芯片由包括聚二甲基硅氧烷、固化剂和表面活性剂的原料制备得到，所述原料中聚二甲基硅氧烷、固化剂和表面活性剂的质量比为10：1：0.002；所述表面活性剂为TritonX-100、吐温80、2-吗啉乙磺酸中的一种或多种；更优选地，所述表面活性剂为TritonX-100。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述数字微流控芯片的制备方法包括如下步骤：将聚二甲基硅氧烷、固化剂和表面活性剂混合后，倒入数字微流控芯片模具，经80℃烘烤2～4h，脱模制备得到。7.根据权利要求1～6任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反应缓冲液，所述反应缓冲液包括如下组分：Mg2+、BSA、荧光染料和dNTPs；所述荧光染料为EvaGreen、LCGreen、SYTO9的一种；优选地，所述荧光染料为EvaGreen；更优选...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵俊，朱灵，刘勇，邓国庆，朱灿灿，崔俊生，杨柯，周喃，
申请(专利权)人：中国科学院合肥物质科学研究院，合肥中科易康达生物医学有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34