一种发酵猴头菌制备高纯度猴头菌多糖的方法和发酵培养基技术

本发明专利技术公开了一种发酵猴头菌制备高纯度猴头菌多糖的方法，属于微生物技术领域。所述方法包括如下：将猴头菌菌株接种到液体种子培养基培养至对数期，将种子转接到发酵培养基中，添加玻璃珠打散菌体，同时添加辅酶促进转化，控制pH值、温度及碳源浓度，置于摇床上振荡发酵，发酵液经酶解使菌丝形成原生质体破壁单细胞，再经加热、脱色，过滤、超滤、反复醇沉、干燥沉淀，即可制得高纯度猴头菌多糖，该多糖纯度可达90％以上，含量约为5～6g/L。

A Method for Preparing High Purity Polysaccharide from Hericium erinaceus by Fermentation and Fermentation Medium

The invention discloses a method for preparing high purity polysaccharide from Hericium erinaceus by fermentation, which belongs to the field of microbial technology. The method comprises the following steps: inoculating Hericium erinaceus strains into liquid seed culture medium to logarithmic phase, transferring seeds to fermentation medium, adding glass beads to disperse bacteria, adding coenzymes to promote transformation, controlling pH value, temperature and carbon source concentration, and putting them into shaking bed for oscillating fermentation. The fermentation liquid is hydrolyzed by enzymolysis to form protoplast-broken single cell, then heated and removed. High purity polysaccharide of Hericium erinaceus can be obtained by filtration, ultrafiltration, repeated alcohol precipitation and dry precipitation. The purity of the polysaccharide can reach more than 90%, and the content is about 5-6 g/L.

【技术实现步骤摘要】
一种发酵猴头菌制备高纯度猴头菌多糖的方法和发酵培养基
本专利技术涉及微生物发酵工程领域，特别涉及一种发酵猴头菌制备猴头菌多糖的方法和发酵培养基。
技术介绍
猴头菌又名猴头菇、熊头菇、刺猬菌，属多孔菌目齿菌科猴头属，是我国著名的食药兼用菌。徐光启《农政全书》记载，其味鲜美、清香可口。民间常用其治疗消化不良、神经衰弱。据记载，猴头菌具“助消化、利五脏”之功效。现代医学证明猴头菌对消化道疾病和恶性肿瘤疗效显著，大量研究发现猴头菌的生物活性主要来自其多糖，猴头菌多糖对免疫调节、癌症治疗、降糖降脂、抗氧化抗衰老等具有重大功效，是一种富有开发潜能、应用前景广阔的真菌多糖。日本及欧美国家20世纪30年代开始真菌多糖的研究，积累了大量科研资料，我国60年代开始研究，90年代成为研究热点。近年来，一些多糖类药物迅速进入市场，成为新型药品和保健品。然而伴随猴头菌多糖的研究越来越饱受关注，市场上同时出现了许多参差不齐的多糖原料，仅以子实体部分粗多糖充当纯品真菌多糖的现象屡见不鲜。所以开发一种制备高纯度猴头菌多糖且适合放大生产的产品工艺十分迫切。猴头菌多糖根据其存在部位可分为胞内多糖和胞外多糖，胞内多糖存在于菌丝细胞内，胞外多糖指液体培养条件下分泌到培养液中的多糖，传统工艺多采用从猴头菌干品中提取分离或者从发酵液中的菌丝体中获得，而发酵液中的胞外多糖往往被人忽略。如各类保健品中的活性多糖多采用从猴头菌子实体中加工获得，猴头菌子实体从制种到采收约2～3个月，由于周期长、消耗大、菌株退化、栽培污染以及干品提取步骤繁琐、生产成本高等问题导致产率较低且产量不稳定。利用微生物的深层发酵，提高胞内、胞外多糖发酵产量，高效制备高纯度产品将是今后研究重点及主流趋势。专利文献1中公开了“一种猴头菌多糖及其制备方法”，首先将猴头菌进行醇沉干燥制备粗多糖，粗多糖再经离子交换树脂吸附处理，可得最终猴头菌多糖。该工艺中步骤虽较为简单但离子交换法效率较低难以放大生产，且未对多糖纯度进行研究。专利文献2中公开了“一种提取猴头菌多糖的方法”，取猴头菌子实体部分进行粉碎，对比使用微波、热水浸提、超声三种方式进行提取，最后经浓缩醇沉、干燥即可制得产品。该工艺虽在醇沉过程中可除去部分小分子杂质，但并未涉及大分子杂质如蛋白杂质的去除，产品纯度不高。专利文献3中公开了“一种猴头菌活性多糖及其制备方法”，该工艺过程将猴头菌多糖进行原料预处理，超声降解，最终经冷冻干燥制得猴头菌高活性多糖产品。该专利工艺过程虽较为简单，但冷冻干燥工艺因成本较高并不适合生产放大。另外该专利并未对猴头菌多糖的原料来源加以说明。非专利文献1公开了一篇“猴头菌丝多糖的发酵生产及其提取工艺优化”的文章，该工艺过程为猴头菌菌丝发酵，收集菌丝，菌丝经热水浸提，再用无水乙醇沉淀制备多糖，该工艺过程中仅收集菌丝体而发酵液中存在的胞外多糖被弃掉，同时对制备的多糖纯度并未说明。非专利文献2公开了一篇“猴头菌液体发酵及多糖的提取纯化研究”的论文，该论文从发酵优化到最终纯化制备了三个组分的纯多糖，最终三个组分多糖含量为84.31％，78.47％和72.16％，其产品纯度仍有待提高。从上述文章及专利来看，对于猴头菌多糖的研究较多集中在产品活性上，目前尚无一种通过发酵法来高效制备高纯度猴头菌总多糖(胞内多糖及胞外多糖)且适用于生产放大的工艺，该研究尚属空白，主要难点为：1.发酵产率较低；2.纯化工艺中较多杂质无法完全去除。现有技术文献专利文献专利文献1:CN102643359A专利文献2:CN103044563A专利文献3:CN106478829A非专利文献非专利文献1：“猴头菌丝多糖的发酵生产及其提取工艺优化”，内蒙古科技大学数理与生物工程学院，农业机械，2011(23):167-169.非专利文献2：“猴头菌液体发酵及多糖的提取纯化研究”，江苏大学硕士论文，2008.
技术实现思路
基于此现状本专利技术旨在提供一种通过发酵猴头菌制备高纯度猴头菌多糖的方法，为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：1.一种发酵猴头菌制备高纯度猴头菌多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：将猴头菌菌种接种到种子培养基中，振荡培养种子，得到种子液；步骤2：将步骤1中的种子液接种到包含玻璃珠的发酵培养基中；步骤3：发酵过程中进行温度控制和pH控制，同时补加碳源；步骤4：发酵结束后添加真菌酶进行酶解，得到含有破壁细胞的发酵液；和步骤5：对发酵液进行处理，得到猴头菌多糖。2.根据项1所述的方法，其特征在于，步骤1中，所用猴头菌的保藏编号为CCTCCNO:M2018567。3.根据项1所述的方法，其特征在于，步骤1中，所述种子培养基包括以下组分：1～10质量％的碳源、1～5质量％的有机氮源、0.5～1质量％的无机氮源、0.01～0.1质量％的无机盐。4.根据项1所述的方法，其特征在于，步骤2中，所述发酵培养基包括以下组分：1～5质量％的碳源、1～5质量％的有机氮源、0.5～1质量％的无机氮源、0.01～1质量％的无机盐、0.0001～0.001质量％的微量元素，0.0001～0.001质量％的辅酶，0.05～1质量％的分散剂，玻璃珠10～50粒/100mL，分散剂为选自吐温80、EDTA和吐温60中任意一种或多种。5.根据项1所述的方法，其特征在于，步骤3中，所述温度控制为：发酵2～3天发酵温度设为24～30℃，发酵3～10天发酵温度设为20～24℃。6.根据项1所述的方法，其特征在于，步骤3中，所述pH控制为：发酵2～3天时发酵pH自然，发酵3～10天时pH设为5.0～5.5。7.根据项1所述的方法，其特征在于，步骤3中，发酵4～6天时开始补加碳源，维持发酵液碳源浓度为1～1.5质量％。8.根据项1所述的方法，其特征在于，步骤3中，发酵至7～8天停止补加糖，发酵终点为发酵液中无残糖。9.根据项1所述的方法，其特征在于，步骤4中，酶解过程在摇床上进行，摇床转速为200～300rpm。10.根据项1所述的方法，其特征在于，步骤4中，所述真菌酶为选自纤维素酶、蜗牛酶、蛋白酶、真菌溶壁酶中的一种或多种，添加量为0.1～1质量％，酶解时间为60～120min。11.根据项1所述的方法，其特征在于，步骤5中，所述处理包括加热、脱色、过滤、超滤、醇沉和干燥。12.根据项11所述的方法，其特征在于，所述加热的温度为50～100℃，加热时间为10～60min。13.根据项11所述的方法，其特征在于，所述脱色为活性炭吸附脱色，活性炭为选自针剂型、椰壳型、木质粉状型和煤质柱状型中的一种或多种活性炭，发酵液中添加活性炭的量为0.1～1质量％，吸附温度为30～80℃，吸附时间为30～120min。14.根据项11所述的方法，其特征在于，所述过滤中所用的滤膜的孔径为0.22μm。15.根据项11所述的方法，其特征在于，所述超滤中所用的滤膜的截留分子量为1000～5000Da。16.根据项11所述的方法，其特征在于，所述醇沉为使用乙醇沉淀，所用乙醇体积为滤液的2～5倍。17.根据项1所述的方法，其特征在于，通过该方法制得的猴头菌多糖的含量为5～6g/L，纯度为90％以上。18.一种发酵培养基，其特征在于，其组成为1～5质量％的碳源、1～5质量％的有机氮源、0.5～本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种发酵猴头菌制备高纯度猴头菌多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：将猴头菌菌种接种到种子培养基中，振荡培养种子，得到种子液；步骤2：将步骤1中的种子液接种到包含玻璃珠的发酵培养基中；步骤3：发酵过程中进行温度控制和pH控制，同时补加碳源；步骤4：发酵结束后添加真菌酶进行酶解，得到含有破壁细胞的发酵液；和步骤5：对发酵液进行处理，得到猴头菌多糖。

【技术特征摘要】
1.一种发酵猴头菌制备高纯度猴头菌多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：将猴头菌菌种接种到种子培养基中，振荡培养种子，得到种子液；步骤2：将步骤1中的种子液接种到包含玻璃珠的发酵培养基中；步骤3：发酵过程中进行温度控制和pH控制，同时补加碳源；步骤4：发酵结束后添加真菌酶进行酶解，得到含有破壁细胞的发酵液；和步骤5：对发酵液进行处理，得到猴头菌多糖。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中，所用猴头菌的保藏编号为CCTCCNo:M2018567。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中，所述种子培养基包括以下组分：1～10质量％的碳源、1～5质量％的有机氮源、0.5～1质量％的无机氮源、0.01～0.1质量％的无机盐。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中，所述发酵培养基包括以下组分：1～5质量％的碳源、1～5质量％的有机氮源、0.5～1质量％的无机氮源、0.01～1质量％的无机盐、0.0001～0.001质量％的微量元素，0.0001～0.001质量％的辅...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾玉倩，陆震，魏玉洁，杨旭，孙元军，石艳丽，郭学平，栾贻宏，
申请(专利权)人：华熙福瑞达生物医药有限公司，山东华熙海御生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37