一种牛磺酸修饰的新型巨乌贼明胶多功能肽的制备方法技术

本发明专利技术提供一种牛磺酸修饰的新型巨乌贼明胶多功能肽的制备方法，属于生物技术领域，该方法中，1）提供羧基组分，其羧基组分源于氨基酸序列为SEQ ID NO.1的保护性肽片段；2）提供氨基组分，其氨基组分源于牛磺酸；3）提供缩合剂存在的缩合反应，在羧基组分和氨基组分间形成肽键，上述缩合反应是在甲酰甘氨酸和对氨基苯丙氨酸的存在下进行；4）提供脱氨基保护反应，上述反应可脱除缩合反应产物上氨基端的保护基团。本发明专利技术提供的新型多功能肽的制备方法反应速度快，合成耗时短，反应转化率高，生产成本低，产物活性和纯度高，副产物生成少，所制多功能肽具有抗氧化、清除自由基、促进大脑发育等生物活性功能。

A New Taurine Modified Gelatin Multifunctional Peptide from Cuttlefish

The invention provides a preparation method of a novel taurine-modified giant squid gelatin multifunctional peptide, which belongs to the field of biotechnology. In this method, 1) carboxyl component is provided, and its carboxyl component is derived from the protective peptide fragment of amino acid sequence SEQ ID NO.1; 2) amino component is provided, and its amino component is derived from taurine; 3) condensation reaction exists in the condensation agent, and in the carboxyl component. The above condensation reaction is carried out in the presence of formylglycine and p-aminophenylalanine. 4) It provides deamination protection reaction, and the above reaction can remove the protective groups at the amino end of the condensation product. The preparation method of the novel multi-functional peptide provided by the invention has the advantages of fast reaction speed, short synthesis time, high reaction conversion rate, low production cost, high activity and purity of the product, and less by-product formation. The prepared multi-functional peptide has the functions of antioxidation, free radical scavenging, promoting brain development and other biological activities.

【技术实现步骤摘要】
一种牛磺酸修饰的新型巨乌贼明胶多功能肽的制备方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种牛磺酸修饰的新型巨乌贼明胶多功能肽的制备方法。
技术介绍
明胶是由胶原蛋白经适度水解生成的一种高分子天然多肽聚合物，因其独特的理化特性而被广泛应用于食品、医药等领域。目前，市场上98.5％的商业明胶主要来源于猪和牛的皮与骨，但受“疯牛病”、“口蹄疫”等传染性疾病引发的食用安全性、宗教信仰者的饮食习惯、素食主义者特殊需求和明胶市场原料短缺的影响，亟需寻找一种可替代哺乳动物明胶的新型明胶原料。鱼明胶因具有与哺乳动物明胶类似的理化性质而被认为是一种最具潜力的哺乳动物明胶替代物。但与哺乳动物明胶相比，鱼明胶具有较低的流变学特性、凝胶性、乳化稳定性等理化特性导致其不可完全替代哺乳动物明胶，限制了其在食品、医药等领域的应用。目前多采用天然蛋白水解法将明胶水解，形成活性多肽，表现出诸如清除自由基、抗氧化、免疫调节、促矿物质吸收等多种活性。经明胶经水解后，其加工功能性显著提高，营养价值突出，与游离氨基酸相比，肽的吸收显示出了明显的优势，肽的吸收效率明显高于同等浓度氨基酸的吸收效率，并且明胶生理活性增强。自然状态下，功能性的肽片断没有被释放出来，不显示活性，经酶解后将含有特定序列的肽片段释放出来，其生理活性也就呈现出来了。WreshaMendis等用胰蛋白酶水解巨乌贼皮肤明胶，从其水解液中分离得到相对分子量为880Da，序列为Phe-Asp-Ser-Gly-Pro-Ala-Gly-Val-Leu的多肽，该肽对脂质过氧化具有很强的抑制作用，优于α-生育酚，具有很高的自由基清除能力。牛磺酸，即2–氨基乙磺酸最早于1827年从雄牛的胆汁中分离得到，它与天然氨基酸不同。天然氨基酸是α位氨基，而牛磺酸为β位氨基，牛磺酸带有磺基而非羧基，所以牛磺酸是生物体内一种特殊的氨基酸。在动物包括人体内，牛磺酸对于心血管、脑神经、肌肉运动、免疫和视觉等系统都起着良好的调节作用，尤其是对婴儿的大脑和视神经发育有促进作用。牛磺酸则是调节机体正常生理活动的活性物质，具有广泛的生理功能，如促进婴幼儿脑组织和智力发育、增强细胞抗氧化能力，在临床上已被广泛应用于心血管疾病、糖尿病、消化道疾病、神经系统疾病、眼部疾病等一系列疾病的治疗。牛磺酸的分布十分广泛，海洋生物，特别是海鱼、贝类，如墨鱼、章鱼、虾、牡蛎、海螺、蛤蜊等牛磺酸含量最为丰富。现利用牛磺酸这一多功能活性物质，对单一抗氧化活性的巨乌贼皮肤明胶多肽进行修饰，可获得同时具备牛磺酸生物活性和巨乌贼皮肤明胶多肽抗氧化活性的新型多功能肽。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种反应速度快、合成耗时短、反应转化率高、生产成本低、产物活性和纯度高、副产物生成少的牛磺酸修饰的新型巨乌贼明胶多功能肽的制备方法，所制多功能肽具有抗氧化、清除自由基、促进大脑发育等生物活性功能。本专利技术为实现上述目的所采取的技术方案为：一种牛磺酸修饰的新型巨乌贼明胶多功能肽的制备方法，包括：1)提供羧基组分，上述羧基组分源于氨基酸序列为SEQIDNO.1的保护性肽片段；2)提供氨基组分，上述氨基组分源于牛磺酸；3)提供缩合剂存在的缩合反应，在羧基组分和氨基组分间形成肽键，上述缩合反应是在甲酰甘氨酸和对氨基苯丙氨酸的存在下进行；4)提供脱氨基保护反应，上述反应可脱除缩合反应产物上氨基端的保护基团。牛磺酸是一种多功能活性物质，利用牛磺酸对单一抗氧化活性的巨乌贼皮肤明胶多肽进行修饰，可获得同时具备牛磺酸生物活性和巨乌贼皮肤明胶多肽抗氧化活性的新型多功能肽，具有抗氧化、清除自由基、促进大脑发育等多种生物活性功能。作为优选，保护性肽片段氨基端的保护基团是芴甲基羰基；上述肽片段为巨乌贼皮肤明胶经蛋白酶水解所得。该肽片段是用胰蛋白酶水解巨乌贼皮肤明胶，从其水解液中分离得到的相对分子量为880Da的多肽，该肽具有很高的自由基清除能力。芴甲基羰基为碱敏感保护基，可与大范围的溶剂、试剂相兼容，机械稳定性高，可用多种载体和多种活化方式。作为优选，保护性肽片段通过如下步骤制备：取多肽溶解于浓度为10～15％的碳酸钠溶液中，然后取芴甲基羰基酰氯溶于丙酮中，再将上述两种溶液混合，冰浴搅拌，再于室温下搅拌反应，然后用乙醚萃取，用浓盐酸调节pH至2～3，析出沉淀，将沉淀用乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥后，用石油醚析出沉淀，即得。多肽的合成离不开氨基酸保护基团，氨基酸保护基在反应中对需要保护的基团有选择性的保护，且保护后的氨基酸有较好的稳定性，同时能在接肽反应后高收率地选择性脱去，且不影响生成的肽键。进一步优选，制备步骤中各反应条件如下：多肽与芴甲基羰基酰氯的重量比为1:4～5，冰浴温度为-4～0，℃时间为20～30min，室温反应时间为1.5～2.5h。再进一步优选，保护性肽片段具体制备步骤如下：取多肽溶解于10～15倍量、浓度为10～15％的碳酸钠溶液中，然后取多肽4～5倍量的芴甲基羰基酰氯，溶于多肽10～12倍量的丙酮中，再将上述两种溶液混合，于-4～0℃冰浴中搅拌20～30min，然后室温搅拌反应1.5～2.5h，再用乙醚萃取2～3次后，用浓盐酸调节pH至2～3，析出沉淀，将沉淀用乙酸乙酯萃取2～3次，无水硫酸镁干燥后，用石油醚析出沉淀，即得。作为优选，缩合反应步骤如下：取保护性肽片段和缩合剂，加入四氢呋喃溶解后，再加入牛磺酸和甲酰甘氨酸、对氨基苯丙氨酸，置于微波反应器中反应，反应完成后，抽滤除去滤液，用二氯甲烷清洗1～2次，即得多肽粗品。在缩合反应中，牛磺酸中含有的能提供孤对电子的氨基，与多肽中C端的羧基或羧基残基结合，从而形成一种牛磺酸修饰的新型多功能肽。微波技术通过加热方式，促成化学物质的有机合成反应，并且在加热作用下，降低合成反应中的物质活化能，加快反应速度，合成反应所需的时间较短，且反应转化率也相对较高。进一步优选，缩合反应条件如下：微波温度为20～70℃，时间为10～15min；保护性肽片段和缩合剂的重量比为1:1～1.2，牛磺酸添加量为保护性肽片段重量的1～1.5倍，甲酰甘氨酸和对氨基苯丙氨酸的添加量分别为缩合剂重量的0.08～0.15％和0.12～0.21％。在缩合反应中，甲酰甘氨酸和对氨基苯丙氨酸的加入，打破体系中的电负荷平衡状态，催化氨基和裸露的羧基缩合形成酰胺键，产生新的聚集体，利用位阻效应改善了肽的立体构象和三维结构，从而增强了反应效率和产物的活性，同时两者上的基团可以与肽片段侧链上的活性基团之间形成较弱的氢键，以此减少反应中副产物的生成，提高产物的产率和纯度。进一步优选，缩合剂为二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、1-羟基苯并三氮唑或二异丙基乙基胺。作为优选，脱氨基保护反应步骤为：将多肽粗品加入脱保护基试剂中，然后置于微波中反应，反应完成后，向反应液中加入冰乙醚进行沉淀，然后离心除去上清液，即得新型多功能肽。芴甲氧羰基对酸稳定，较易通过简单的胺脱保护，被保护的胺以游离碱释出。进一步优选，脱保护基试剂为含20～30％哌啶的二氯甲烷溶液；上述微波反应温度为30～60，℃时间为5～15min。本专利技术的有益效果为：1)本专利技术中利用牛磺酸修饰巨乌贼明胶多肽，形成新型多功能肽，该活性生物肽具备牛磺酸生物活性和巨乌贼皮肤明胶多肽抗氧化活性，具有抗氧化、清除自本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种牛磺酸修饰的新型巨乌贼明胶多功能肽的制备方法，其特征在于：提供羧基组分，所述羧基组分源于氨基酸序列为SEQ ID NO.1的保护性肽片段；提供氨基组分，所述氨基组分源于牛磺酸；提供缩合剂存在的缩合反应，在羧基组分和氨基组分间形成肽键，所述缩合反应是在甲酰甘氨酸和对氨基苯丙氨酸的存在下进行；提供脱氨基保护反应，所述反应可脱除缩合反应产物上氨基端的保护基团。

【技术特征摘要】
1.一种牛磺酸修饰的新型巨乌贼明胶多功能肽的制备方法，其特征在于：提供羧基组分，所述羧基组分源于氨基酸序列为SEQIDNO.1的保护性肽片段；提供氨基组分，所述氨基组分源于牛磺酸；提供缩合剂存在的缩合反应，在羧基组分和氨基组分间形成肽键，所述缩合反应是在甲酰甘氨酸和对氨基苯丙氨酸的存在下进行；提供脱氨基保护反应，所述反应可脱除缩合反应产物上氨基端的保护基团。2.根据权利要求1所述的一种牛磺酸修饰的新型巨乌贼明胶多功能肽的制备方法，其特征在于：所述保护性肽片段氨基端的保护基团是芴甲基羰基；所述肽片段为巨乌贼皮肤明胶经蛋白酶水解所得。3.根据权利要求1所述的一种牛磺酸修饰的新型巨乌贼明胶多功能肽的制备方法，其特征在于：所述保护性肽片段通过如下步骤制备：取多肽溶解于浓度为10~15%的碳酸钠溶液中，然后取芴甲基羰基酰氯溶于丙酮中，再将上述两种溶液混合，冰浴搅拌，再于室温下搅拌反应，然后用乙醚萃取，用浓盐酸调节pH至2~3，析出沉淀，将沉淀用乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥后，用石油醚析出沉淀，即得。4.根据权利要求3所述的一种牛磺酸修饰的新型巨乌贼明胶多功能肽的制备方法，其特征在于：所述制备步骤中各反应条件如下：多肽与芴甲基羰基酰氯的重量比为1:4~5，冰浴温度为-4~0℃，时间为20~30min，室温反应时间为1.5~2.5h。5.根据权利要求1所述的一种牛磺酸修饰的新型巨乌...

【专利技术属性】
技术研发人员：金火喜，徐红萍，曾明，谢辉，杨立业，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33