一种昆虫病原线虫活体培养方法技术

本发明专利技术公开了一种昆虫病原线虫活体培养方法。本发明专利技术通过配制接种液、浸泡式接种昆虫病原线虫、收集接种后的大蜡螟末龄幼虫、通过自制抽届式培养箱，通气培养昆虫病原线虫，得到大量昆虫病原线虫。本发明专利技术利用大蜡螟末龄幼虫进行活体培养，创造性的通过浸泡式接种方法和通气抽届恒温箱培养实现了昆虫病原线虫的规模化活体培养。通过适宜的温度和湿度实现寄生的昆虫病原线虫在大蜡螟幼虫体中大量繁殖。本发明专利技术实现了昆虫病原线虫活体培养中对大蜡螟进行集中接种和培养，解决了传统活体培养方法中所需大量的劳动力的矛盾。

A method for in vivo culture of entomopathogenic nematodes

The invention discloses a method for in vivo cultivation of entomopathogenic nematodes. The invention obtains a large number of entomopathogenic nematodes by preparing inoculation solution, immersing inoculation of entomopathogenic nematodes, collecting the last larvae of the inoculated wax borer, ventilating and culturing the entomopathogenic nematodes through a self-made suction incubator. The invention utilizes the last instar larvae of the wax borer to carry out in vivo culture, and creatively realizes the large-scale in vivo cultivation of entomopathogenic nematodes by immersion inoculation method and ventilated pumping thermostat culture. The parasitic insect pathogenic nematodes multiply in the larvae of the giant wax borer through appropriate temperature and humidity. The invention realizes centralized inoculation and cultivation of the wax borer in vivo cultivation of insect pathogenic nematodes, and solves the contradiction of a large amount of labor required in the traditional in vivo cultivation method.

【技术实现步骤摘要】
一种昆虫病原线虫活体培养方法
本专利技术涉及生物繁殖培养
，更具体地，涉及一种昆虫病原线虫活体培养方法。
技术介绍
昆虫病原线虫是一类以昆虫为寄主的致病性线虫，以侵染期虫态存活于土壤中，浸染期线虫不取食，独立于昆虫体外自由生活，寻找或入侵昆虫寄主。线虫感染害虫主要经过侵染寄主，潜伏释放共生菌及毒素和害虫致死三个阶段，进入昆虫体内后，肠内共生菌会在昆虫的血体腔中大量繁殖，产生毒素致昆虫死亡，并分解昆虫组织，以作为线虫食物来源。这种共生系统有利于生物防治害虫。昆虫病原线虫搜索寄主能力强，侵染致死有效性高，起效时间快，对人畜、天敌、环境安全，是一类重要的害虫生物防治因子，已广泛应用于防治果树、蔬菜和草坪等害虫。目前，在现有昆虫病原活体培养中，主要是将昆虫病原线虫接种液逐个滴加到装有大蜡螟幼虫小试管中进行接种并培养，最后得到昆虫病原线虫。这种方法，需要逐条将大蜡螟装入小试管，并逐条接种。消耗了大量人力，而且费时，劳动效率低，无法满足实际农业生产的需求。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是针对现有技术中昆虫病原线虫培养中接种慢、效率低的不足，提供一种昆虫病原线虫活体培养的方法。本专利技术的目的通过以下技术方案予以实现：S1.接种液配制：按所需浓度要求，配制昆虫病原线虫浓度为1万～5万尾/ml的接种液；S2.接种：将大蜡螟幼虫浸泡入步骤S1所得昆虫病原线虫接种液中，浸泡5～10分钟，当75～85％的大蜡螟假死不动时将大蜡螟取出；S3.培养：将步骤S2所得浸泡后的活体大蜡螟幼虫移入灭菌布上，恒温恒湿培养；S4.选检：接种、培养后第5～7天，将体表面发霉、变黑和水肿的大蜡螟尸体检出；S5.收集：接种、培养后第10～15天时将选检后剩余的大蜡螟尸体磨碎后浸泡于无菌水中，静置分离，去上清液，收集下层沉淀液重复以上操作3～5次，合并沉淀物即收集得到昆虫病原线虫。优选地，步骤S1中所述昆虫病原线虫液浓度为5万条/ml。进一步地，步骤S2中，大蜡螟与接种液中昆虫病原线虫数量比为1:1～5万。,浸泡时间为5～10min；接种液温度为20～30℃，接种室温20～30℃。优选地，步骤S2中浸泡时间为7分钟，接种液温度为25℃，接种室温25℃当80％的大蜡螟假死不动时将大蜡螟取出。进一步地，步骤S3中，所述灭菌布平铺于可叠加托盘内，托盘底部设置有多个均匀排布的贯通小孔，使得每层温度、湿度相对统一、稳定。进一步地，步骤S3中，所述恒温温度为20～30℃；所述恒湿湿度为93～100％。优选地，步骤S3中，所述恒温温度为28℃，所述恒温湿度为95％。进一步地，步骤S3培养过程中需不断通入饱和水汽，保持生长湿度，另一方面提供昆虫病原线虫所需氧，并将昆虫病原线虫繁殖所产生的二氧化碳以及氨气排出培养系统。优选地，所述饱和水汽由氢氧化钠溶液雾化而成，其中氢氧化钠溶液中氢氧化钠浓度为0.1～0.8‰。进一步地，步骤S5所述静置时间为60～180min，所述浸泡时间为30～60min；重复以上操作次数3～5次，整个过程室温控制在20～30℃。进一步地，步骤S5中磨碎后的大蜡螟尸体与无菌去离子水的质量比1：1～4。与现有技术相比，有益效果是：本专利技术利用大蜡螟幼虫进行活体培养，创造性的通过浸泡式接种方法，实现了短时间接种大量大蜡螟。通过自制抽届式培养箱，按制适宜的温度和湿度，并对昆虫病原线虫供氧，实现利用大蜡螟末龄幼虫集中活体培育昆虫病原线虫。由于本专利技术中每只大蜡螟幼虫中携带有大量昆虫病原线虫，利用含低浓度的氢氧化钠溶液的饱和水汽润湿的无菌布做载体，为生长所需提供适宜的湿度，并具有一定的消毒抑菌作用，大大提高了大蜡螟幼虫的成活率，促进了昆虫病原线虫的快速繁殖。因此，空间利用率高，同时降低了活体线虫培养的经济消耗。由于昆虫病原线虫能够低成本、高效地大量培养，使其走向工厂化生产规模。本专利技术培养繁殖过程中未引入其他试剂，步骤简单可行，而且各步骤剩余的溶液、物质均可重复利用，极大的节约了成本。附图说明图1多个托盘叠放图；图2托盘底部示意图；其中，1为多个托盘叠加装置；2为单个托盘；3为贯通小孔；4为托盘底部。具体实施方式下面结合实施例进一步解释和阐明，但具体实施例并不对本专利技术有任何形式的限定。若未特别指明，实施例中所用的方法和设备为本领常规方法和设备，所用原料均为常规市售原料。实施例1S1.接种液配制：按所需浓度要求，配制浓度为1万尾/ml的昆虫病原线虫接种液；S2.接种：将大蜡螟幼虫浸泡入20℃步骤S1所得昆虫病原线虫接种液中；大蜡螟幼虫与接种液中昆虫病原线虫的数量比为1:10000,浸泡时间为5min时，75％的大蜡螟假死不动时即可将大蜡螟幼虫取出；接种室温20℃；S3.培养：将步骤S2所得浸泡后的活体大蜡螟幼虫移入铺有灭菌布的可叠加托盘上，于20℃、93％的湿度条件下不断通入由0.1％。的氢氧化钠溶液雾化得到的饱和水汽，恒温恒湿培养；S4.检测：接种、培养后第5天，将体表面发霉、变黑和水肿的大蜡螟尸体检出；S5.收集：接种、培养后第15天时将选检后剩余的大蜡螟尸体磨碎后浸泡于无菌水中30min，其中大蜡螟尸体与无菌水质量比为1：1，静置60min后分离，去上清液，收集下层沉淀液重复以上操作1次，合并沉淀物即收集得到昆虫病原线虫。实施例2S1.接种液配制：按所需浓度要求，配制浓度为2万尾/ml的昆虫病原线虫接种液；S2.接种：将大蜡螟幼虫浸泡入22℃步骤S1所得昆虫病原线虫接种液中；大蜡螟幼虫与接种液中的昆虫病原线虫的数量比为1:20000,浸泡时间为7min时，80％的大蜡螟假死不动时即可将大蜡螟幼虫取出；接种室温22℃；S3.培养：将步骤S2所得浸泡后的活体大蜡螟幼虫移入铺有灭菌布的可叠加托盘上，于25℃、95％的湿度条件下不断通入由0.3％。的氢氧化钠溶液雾化得到的饱和水汽，恒温恒湿培养；S4.检测：接种、培养后第7天，将体表面发霉、变黑和水肿的大蜡螟尸体检出；S5.收集：接种、培养后第15天时将选检后剩余的大蜡螟尸体磨碎后浸泡于无菌水中42min，其中大蜡螟尸体与无菌水质量比为1：2，静置90min后分离，去上清液，收集下层沉淀液重复以上操作2次，合并沉淀物即收集得到昆虫病原线虫。实施例3S1.接种液配制：按所需浓度要求，配制浓度为5万尾/ml的昆虫病原线虫接种液；S2.接种：将大蜡螟幼虫浸泡入25℃步骤S1所得昆虫病原线虫接种液中；大蜡螟幼虫与接种液中的昆虫病原线虫的数量比为1:30000,浸泡时间为7min时，80％的大蜡螟假死不动时即可将大蜡螟幼虫取出；接种室温25℃；S3.培养：将步骤S2所得浸泡后的活体大蜡螟幼虫移入铺有灭菌布的可叠加托盘上，于28℃、95％的湿度条件下不断通入由0.6％。的氢氧化钠溶液雾化得到的饱和水汽，恒温恒湿培养；S4.检测：接种、培养后第7天，将体表面发霉、变黑和水肿的大蜡螟尸体检出；S5.收集：接种、培养后第15天时将选检后剩余的大蜡螟尸体磨碎后浸泡于无菌水中60min，其中大蜡螟尸体与无菌水质量比为1：2，静置140min后分离，去上清液，收集下层沉淀滤重复以上操作3次，合并沉淀物即收集得到昆虫病原线虫。实施例4S1.接种液配制：按所需浓度要求，配制浓度为4万尾/ml的昆虫病原线虫接种液；S2.接种：将本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种昆虫病原线虫活体培养方法，其特征在于：具体步骤包括：S1.接种液配制：按所需浓度要求，配制昆虫病原线虫浓度为1万~5万尾/ml的接种液；S2.接种：将大蜡螟幼虫浸泡入步骤S1所得昆虫病原线虫接种液中，当75~85%的大蜡螟假死不动时将大蜡螟取出；S3.培养：将步骤S2所得浸泡后的活体大蜡螟幼虫移入灭菌布上，恒温恒湿培养；S4.选检：接种、培养后第5~7天，将体表面发霉、变黑和水肿的大蜡螟尸体检出；S5.收集：接种、培养后第10~15天时将选检后剩余的大蜡螟尸体磨碎后浸泡于无菌水中，静置分离，去上清液，收集下层沉淀液重复以上操作3~5次，合并沉淀物即收集得到昆虫病原线虫。

【技术特征摘要】
1.一种昆虫病原线虫活体培养方法，其特征在于：具体步骤包括：S1.接种液配制：按所需浓度要求，配制昆虫病原线虫浓度为1万~5万尾/ml的接种液；S2.接种：将大蜡螟幼虫浸泡入步骤S1所得昆虫病原线虫接种液中，当75~85%的大蜡螟假死不动时将大蜡螟取出；S3.培养：将步骤S2所得浸泡后的活体大蜡螟幼虫移入灭菌布上，恒温恒湿培养；S4.选检：接种、培养后第5~7天，将体表面发霉、变黑和水肿的大蜡螟尸体检出；S5.收集：接种、培养后第10~15天时将选检后剩余的大蜡螟尸体磨碎后浸泡于无菌水中，静置分离，去上清液，收集下层沉淀液重复以上操作3~5次，合并沉淀物即收集得到昆虫病原线虫。2.根据权利要求1所述的昆虫病原线虫活体培养方法，其特征在于：步骤S2中，大蜡螟与接种液中昆虫病原线虫数量比为1:1~5万。3.根据权利要求1所述的昆虫病原线虫活体培养方法，其特征在于：步骤S2所述浸泡时间为5~10min，接种液温度为20~30℃，接种室温度20~30℃。4.根据权利要求1所述的昆虫病原线虫...

【专利技术属性】
技术研发人员：李小龙，张凤琴，何农跃，
申请(专利权)人：李小龙，
类型：发明
国别省市：湖南,43