一种提高胚乳生物反应器中重组蛋白表达水平的方法技术

本发明专利技术提供一种提高胚乳生物反应器重组蛋白表达水平的方法，所述方法利用储藏谷蛋白突变体(LGC‑1)杂交、基因编辑(TALEN技术和CripsrCas9)技术定向敲除内源储藏蛋白基因，降低内源储藏蛋白含量，缓解内质网胁迫，改善重组蛋白在胚乳细胞转运效率，从而提高重组蛋白在胚乳细胞的表达，实现Oryz

A Method for Improving Recombinant Protein Expression in Endosperm Bioreactor

The invention provides a method for improving the expression level of recombinant protein in endosperm bioreactor. The method utilizes hybridization of stored glutenin mutant (LGC_1), gene editing (TALEN technology and CripsrCas9) technology to directionally knock out endogenous storage protein gene, reduce the content of endogenous storage protein, alleviate endoplasmic reticulum stress, improve the transport efficiency of recombinant protein in endosperm cells, and thereby increase weight. Histone expression in endosperm cells to achieve Oryz

【技术实现步骤摘要】
一种提高胚乳生物反应器中重组蛋白表达水平的方法
本专利技术属于生物
，涉及一种通过降低内源蛋白表达，缓解内质网胁迫的技术途径，来提高胚乳生物反应器重组蛋白表达水平的方法。
技术介绍
自1986年以来利用农业生物制药技术通过植物细胞生产在医药、疾病治疗、分子疫苗等方面有着广泛的用途的重组蛋白。由于农业生物制药技术存在表达量低、工艺复杂和规模化困难的问题，一致不能进入市场。因此提高重组蛋白的表达量是农业生物制药的关键核心技术。提高表达量通常采用较强转录活性的启动子、密码子优化和定向储存等技术来提高表达量，本申请人早期采用水稻胚乳特异性启动子、水稻偏爱密码子优化、蛋白质定向存储等综合技术策略(OryzHiExp技术)，实现了多种重组蛋白在水稻胚乳中特异性高水平表达，最高表达量达到了2.76克/公斤糙米(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2011，108(47):19078-19083)，表达量已经达到现有技术的极限(PlantCellReport.2014，33:585–594；NatureNews)。然而通过对高效表达重组蛋白的水稻胚乳细胞的细胞学和分子生物学分析，发现当重组蛋白在水稻胚乳细胞超量表达后，胚乳细胞中的内质网和蛋白体的细胞学形态发生显著改变(JournalofProteomeResearch,2009，8,829–837；JournalofBiotechnol.2012，164：300-308；PlantMolecularBiology.2013,83:153-161)，对其分子机理的研究结果，发现协助蛋白折叠分子伴侣分子提高，内源蛋白显著降低，与此同时，胚乳细胞为了应对超量表达重组蛋白，通过启动未折叠蛋白的应急反应(UnfoldingProteinResponse，UPR)，对外源蛋白进行泛素化，然后介导重组蛋白进入26S蛋白酶体进行降解，以缓解内质网胁迫，保证细胞正常的生长(JournalofProteomeResearch,2009，8,829–837)。根据以上研究结果和发现，要继续提高重组蛋白在胚乳细胞的表达，仅靠提高转录水平，增加mRNA水平是不够的，在超量表达重组蛋白时，过量外源基因的表达，重组蛋白与内源蛋白与内源蛋白基因不仅在基因转录，而且在转译水平上在蛋白转运、蛋白合成、运输和储藏空间等资源进行竞争，在造成内质网胁迫(ERStress)，而胚乳细胞为了应对胁迫，被动地启动一系列应急反应，包括通过增加分子伴侣加快蛋白折叠，最后启动UnfoldingProteinResponse，UPR(Annu.Rev.Med.1999,50,57–74；Mol.Biotechnol.2006,34(2),279–90.)，26S蛋白酶体的蛋白质降解途径来降解过量的蛋白质，缓解内质网胁迫，保障细胞正常发育(图1)。因此，我们假设如果主动通过降低内源蛋白含量，减少胚乳细胞的基因转录、转译和蛋白转运与储藏的负担，就可以提高外源蛋白的表达量(图2)。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对重组蛋白在水稻胚乳细胞超量表达后引起的内质网胁迫，导致内源蛋白含量降低，细胞启动UPR反应，降解内源和外源蛋白的研究结果，提出通过降低内源储藏蛋白含量，缓解胚乳细胞胁迫的技术路线，可以改善重组蛋白的转运效率，提高重组蛋白的表达量。为了证实这个假设，我们利用一个天然的低谷蛋白突变体，该突变体在谷蛋白编码基因增加了一个DNA片段倒置重复，不仅失活了该基因，而且形成了一个类似miRNA的结构，可以显著降低内源谷蛋白的表达(ThePlantCell,2003，15,1455–1467)；采用常规育种方式，利用高效表达重组人血清白蛋白的品系114-7-4与LowGlutelinContent1(LGC-1)进行杂交，经过分子标记辅助选择，在不增加任何基因拷贝数的前提下，在含有LGC-1的基因遗传背景下，重组人血清白蛋白的表达量由2.76g/kg糙米提高到9.6克/kg，提高了3.47倍。采用相同方法将超量表达重组人碱性成纤维生长因子(bFGF)品系与LGC-1杂交，经过分子标记辅助选择，在不增加任何基因拷贝数的前提下，在含有LGC-1的基因遗传背景下，重组人碱性成纤维生长因子的表达量由57mg/kg糙米提高到150mg/kg，提高了2.62倍。采用相同方法将超量表达重组人乳铁蛋白(LF)品系与LGC-1杂交，经过分子标记辅助选择，在不增加任何基因拷贝数的前提下，在含有LGC-1的基因遗传背景下，重组人LF的表达量由1.5g/kg糙米提高到6.1g/kg，提高了4.07倍。这些实例充分证明了通过降低内源蛋白含量，缓解内质网胁迫，为重组蛋白提供更多转录、转译、蛋白转运和储藏的空间可以提高蛋白表达的假设。因此，本专利技术提供一种提高胚乳生物反应器中重组蛋白表达量的方法，所述方法包括通过缓解水稻胚乳细胞内质网胁迫、改善蛋白转运途径来提高重组蛋白的表达量。其中所述缓解水稻胚乳细胞内质网胁迫、改善蛋白转运途径的方法选自下述方法的一种或几种结合：1)自然育种与选育；2)利用基因编辑技术敲除内源储藏蛋白基因降低内源蛋白表达；3)利用内源蛋白的自然突变降低内源蛋白表达。本专利技术方法中，所述自然育种与选育包括下述步骤：(1)以水稻胚乳生物反应器表达外源蛋白稳定的水稻品种为亲本A，以天然Gt1储藏蛋白基因突变体LGC-1或其他储藏蛋白基因突变体为亲本B，，将亲本A与亲本B进行有性杂交，获得F1代种子；(2)利用种植F1代种子，收获单株种子，再次种植得到F2代群体；(3)从F2代群体中，筛选分子标记辅助选择方法筛选具有LGC-1基因的单株，利用用于鉴定Lgc-1和重组蛋白特异性分子标记引物进行PCR扩增，获得具有LGC-1和重组蛋白基因阳性的单株，在成熟时F2代并收获种子；然后对对LGC-1阳性单株的重组人血清白蛋白、重组人乳铁蛋白和重组人成纤维细胞生长因子进行表达量的筛选，(4)在F3代选择表达量最高的单株进行纯合子检测，筛选纯合子单株种植得到F4代群体；(5)从F4代群体中，选择农艺性状稳定，LGC-1和重组蛋白基因纯合的单株。进行加代观察重组蛋白表达量和农艺性状，选择农艺性状和重组蛋白表达量不再分离的单株，培育成高效表达重组蛋白的品系。其中所述的亲本A为选自水稻胚乳特异性启动子介导表达重组人血清白蛋白、重组人乳铁蛋白和重组人成纤维细胞生长因子和其他任何在胚乳细胞表达重组蛋白的水稻品种；本领域技术人员可以理解，其他的由水稻胚乳特异性启动子介导的表达重组蛋白的水稻品种也适用于本专利技术的方法。本专利技术方法中，包含亲本A与亲本B之间的有性杂交，亲本A与亲本B均可以作为母本或父本。根据本专利技术的另一方面，本专利技术方法也可以利用基因编辑(CrisprCas9或TALEN技术)技术敲除水稻储藏蛋白基因，降低内源储藏蛋白的含量，来缓解内质网胁迫，提高重组蛋白在水稻胚乳细胞的表达，所述使用CrisprCas9技术的基因编辑方法包括以下步骤：(a)根据水稻储藏蛋白基因序列设计特异性的设计CrisprCas9；(b)构建CrisprCas9表达载体，采用35S启动子介导CrisprCas9的表达；(c)利用具有CrisprCas9载体通过农杆菌介导的遗传转化本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高胚乳生物反应器中重组蛋白表达量的方法，所述方法包括通过缓解胚乳细胞内质网胁迫、改善蛋白转运途径来提高重组蛋白的表达量。

【技术特征摘要】
1.一种提高胚乳生物反应器中重组蛋白表达量的方法，所述方法包括通过缓解胚乳细胞内质网胁迫、改善蛋白转运途径来提高重组蛋白的表达量。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述缓解水稻胚乳细胞内质网胁迫、改善蛋白转运途径的方法选自下述方法的一种或几种结合：1)自然育种与选育；2)利用基因编辑技术敲除内源储藏蛋白基因降低内源蛋白表达；3)利用内源蛋白的自然突变降低内源蛋白表达。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述自然育种与选育包括下述步骤：(1)以水稻胚乳生物反应器表达外源蛋白稳定的水稻品种为亲本A，以天然Gt1储藏蛋白基因突变体LGC-1或其他储藏蛋白基因为亲本B，将亲本A与亲本B进行有性杂交，获得F1代种子；(2)利用种植F1代种子，收获单株种子，再次种植得到F2代群体；(3)从F2代群体中，筛选分子标记辅助选择方法筛选含有LGC-1基因的单株，利用用于鉴定Lgc-1和重组蛋白特异性分子标记引物进行PCR扩增，获得具有LGC-1和重组蛋白基因阳性的单株，在成熟时F2代并收获种子；然后对LGC-1阳性单株的重组蛋白进行表达量的筛选，(4)在F3代选择表达量最高的单株进行纯合子检测，筛选纯合子单株种植得到F4代群体；(5)...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨代常，曹京，尹恒，李坤鹏，
申请(专利权)人：武汉大学，武汉禾元生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42