本发明专利技术公开了CPR和CYP9A12双基因共表达重组载体，所述重组载体含有CPR基因、小肽2A‑Sig序列和CYP9A12基因，所述CPR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述小肽2A‑Sig序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述CYP9A12基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；并提供了其制备方法和应用。本发明专利技术的有益效果为：本发明专利技术提供的CPR和CYP9A12双基因共表达重组载体及其制备方法和应用，是针对棉铃虫细胞色素P450 CPR‑CYP9A12微粒体酶在体外能够降解棉酚所提供的，能够将外源添加棉酚降解酶用于降低棉籽粕中棉酚含量，从而提高棉籽粕在饲料配方中的用量。
Recombinant vectors co-expressing CPR and CYP9A12 genes and their preparation and Application
The present invention discloses a recombinant vector co-expressing CPR and CYP9A12 genes. The recombinant vector contains CPR gene, small peptide 2A Sig sequence and CYP9A12 gene. The nucleotide sequence of the CPR gene is shown as SEQ ID NO:1, the nucleotide sequence of the small peptide 2A Sig sequence is shown as SEQ ID NO:2, and the nucleotide sequence of the CYP9A12 gene is shown as SEQ ID NO:3. Preparation method and application. The beneficial effects of the present invention are as follows: The CPR and CYP9A12 co-expression recombinant vectors and their preparation methods and applications are provided for cottonseed bollworm cytochrome P450 CPR CYP9A12 microsomal enzymes, which can degrade gossypol in vitro, and can use exogenous gossypol degrading enzymes to reduce gossypol content in cottonseed meal, thereby increasing the dosage of cottonseed meal in feed formulation.
【技术实现步骤摘要】
CPR和CYP9A12双基因共表达重组载体及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物基因工程
，具体涉及CPR和CYP9A12双基因共表达重组载体及其制备方法和应用。
技术介绍
棉酚作为棉花的次生代谢物质，可以诱导棉铃虫P450基因的表达量发生变化。昆虫对外源有毒物质和植物次生代谢物如农药或棉酚等具有耐受性并发挥降解代谢作用主要依赖于细胞色素P450酶。与植物次生代谢物质相关的P450大多为CYP6与CYP9家族。Mao等(2007，2011)分别以可沉默CYP6AE14基因的转基因拟南芥和烟叶饲喂棉铃虫，发现棉铃虫对于棉酚的抵抗力减弱，生长发育受到了显著抑制；并且CYP6AE14在棉铃虫的中肠段高度表达并专一地被棉酚诱导。Zhou等(2010)研究发现棉酚能够诱导棉铃虫中肠和脂肪组织中CYP9A17和CYP9A12基因表达增加。Tao等(2012)的研究证实，在人工饲料中添加棉酚可以诱导棉铃虫中肠P450酶活性，棉铃虫中肠内脱酯酶和P450酶活性显著提高，且CYP6AE14和CYP9A14基因上调。前期研究表明，HPLC和UPLC-QTOF/MS检测结果表明添加棉酚降解酶CPR-CYP9A12作用于棉酚时，棉酚含量会显著性下降，同时棉酚中间代谢物会加速降解。新疆是我国最大的棉籽饼粕生产基地，年产棉籽饼粕150余万吨，但由于棉籽饼粕所含有毒物质棉酚，极大地限制其在动物饲料中的安全应用。棉酚是棉籽腺体中一种黄色的多酚色素，是一种多酚羟基联萘化合物，广泛存在于棉花的根、茎、叶和籽实的色素腺体中。棉酚的毒性来自于游离棉酚，游离棉酚在棉籽饼粕和棉籽壳等棉副产品中普遍存在。棉籽饼粕中的游离棉酚会对单胃动物生长、发育和繁殖等方面产生明显的不良影响，因而限制了其安全而有效的用作畜禽蛋白饲料，造成饲料蛋白资源的严重浪费。目前，尚无从酶学角度研究棉粕生物酶解脱毒的报道，存在的主要问题是：棉酚降解酶难以分离纯化得到，因而其酶类属性、酶蛋白特性、相关基因以及棉酚降解的途径等研究滞后，以致无法从微生物棉酚降解酶基因出发，异源高效表达获得目标酶。但从国内外有关棉铃虫对棉酚和农药的抗性研究中得到启示，发现棉酚降解与细胞色素P450酶系有密切关系。若能将细胞色素P450酶系中具有棉酚降解活性的酶系基因在毕赤酵母菌中异源高效表达，开发棉酚降解酶制剂，则对棉粕酶解脱毒以及揭示棉酚酶促降解途径具有重要的理论意义和实际应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了CPR和CYP9A12双基因共表达重组载体及其制备方法和应用。为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案为：CPR和CYP9A12双基因共表达重组载体，所述重组载体含有CPR基因、小肽2A-Sig序列和CYP9A12基因，所述CPR基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，所述小肽2A-Sig序列的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示，所述CYP9A12基因的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。进一步的，上述的CPR和CYP9A12双基因共表达重组载体，所述CPR基因的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示，所述小肽2A-Sig序列的氨基酸序列如SEQIDNO：5所示，所述CYP9A12基因的氨基酸序列如SEQIDNO：6所示。进一步的，上述的CPR和CYP9A12双基因共表达重组载体，所述载体为pPICZαA质粒载体；所述双基因共表达重组载体为pPICZαA-CPR-2A-αsignalfactor-CYP9A12重组载体。本专利技术的第二个目的是提供了上述CPR和CYP9A12双基因共表达重组载体的制备方法，包括以下步骤：1)利用NCBI数据库，获得棉铃虫CPR和CYP9A12基因的CDS编码区序列，标记其起始密码子编码序列ATG和终止密码子编码序列TGA；2)选取包含CDS区的一段碱基序列，利用NCBIPrimer-BLAST设计引物，所设计的引物为：CPRF：ATGTCAGACAGCGCACAGGAC；CPRR：ACTCCATACATCTGCTGAATAT；CYP9F：ATGATACTAGTCCTGGTCTGGGTGG；CYP9R：CTGCCTAGGTCTGAATCTAAGCC；3)根据步骤2)中的引物，以棉铃虫cDNA为模板扩增CPR和CYP9目的基因连接T-载体；4)以pPICZαA为模板扩增2A-Sig片段，以步骤3)中构建的T-载体为模板，高保真PCR酶扩增含连接片段同源臂的CPR和CYP9A12目的基因片段；5)将单酶切线性化后的pPICZαA质粒和准备好的3个片段，以GibsonAssembly等温连接法一次性构建CPR和CYP9A12双基因共表达重组载体。本专利技术的第三个目的是提供了一种利用上述CPR和CYP9A12双基因共表达重组载体转化宿主细胞所得到的重组菌株。进一步的，上述的重组菌株，所述宿主细胞为毕赤酵母感受态细胞。本专利技术的第四个目的是提供了上述的重组菌株的制备方法，是将线性化的CPR和CYP9A12双基因共表达重组载体电击转入毕赤酵母感受态细胞后，以梯度浓度博来霉素-YPDS培养基筛选阳性菌落，通过MDH和MMH平板培养基对重组毕赤酵母菌进行Mut+和Muts菌株基因型鉴定；提取酵母基因组进行PCR鉴定重组菌；挑取Mut+单克隆菌斑，以BMGY甘油生长复合培养基进行扩培，以BMMY甲醇诱导生长复合培养基进行诱导表达，取不同时间点细胞表达蛋白进行SDS-PAGE和westernblot检测。本专利技术的第五个目的是提供了含有上述CPR和CYP9A12双基因共表达重组载体的棉酚降解酶。本专利技术的第六个目的是提供了上述的棉酚降解酶在制备酶制剂、食品、饲料或生物燃料中的应用。本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的CPR和CYP9A12双基因共表达重组载体及其制备方法和应用，能够将外源添加棉酚降解酶用于降低棉籽粕中棉酚含量，从而提高棉籽粕在饲料配方中的用量。附图说明图1显示为在2A元件串联的棉铃虫细胞色素CPR和CYP基因重组表达载体(即构建pPICZαA-CPR-2A-αsignalfactor-CYP9A12重组质粒示意图)。其中，(a)经过两轮PCR反应，高保真酶扩增2A-α-factorsignal片段，包含完整的2A，信号肽序列和CPR、CYP9A12片段的重叠序列；(b)以pGEM-CPR、pGEM-CYP9A12和pPICZαAvector为模板分别扩增3个目的基因片段，与线性化的pPICZαA质粒进行GA连接；(c)组装成功的pPICZαA-CPR-2A-αsignalfactor-CYP9A质粒。图2显示为在毕赤酵母菌中表达的在不同诱导时间点共表达细胞破碎上清的电泳。其中，泳道1～3代表pPICZαA-CPR-2A-αsignalfactor-CYP9A12-GS115诱导表达时间点24、48和72h；泳道M代表蛋白marker；泳道4代表pPICZαA-GS115。图3显示为Westernblot检测pPICZαA-GS115和pPICZαA-CPR-2A-αsignalfactor-CYP9A12-GS115细胞破碎上清。图4显示为棉酚底物浓度对棉酚降解酶酶活影响。图5显示为UPLC-QTOF/MS检测棉酚代谢物负离子质谱图及代本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.CPR和CYP9A12双基因共表达重组载体，其特征在于，所述重组载体含有CPR基因、小肽2A‑Sig序列和CYP9A12基因，所述CPR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述小肽2A‑Sig序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述CYP9A12基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
【技术特征摘要】
1.CPR和CYP9A12双基因共表达重组载体，其特征在于，所述重组载体含有CPR基因、小肽2A-Sig序列和CYP9A12基因，所述CPR基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，所述小肽2A-Sig序列的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示，所述CYP9A12基因的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。2.根据权利要求1所述的CPR和CYP9A12双基因共表达重组载体，其特征在于，所述CPR基因的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示，所述小肽2A-Sig序列的氨基酸序列如SEQIDNO：5所示，所述CYP9A12基因的氨基酸序列如SEQIDN0：6所示。3.根据权利要求1所述的CPR和CYP9A12双基因共表达重组载体，其特征在于，所述载体为pPICZαA质粒载体；所述双基因共表达重组载体为pPICZαA-CPR-2A-αsignalfactor-CYP9A12重组载体。4.权利要求1所述的CPR和CYP9A12双基因共表达重组载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)利用NCBI数据库，获得棉铃虫CPR和CYP9A12基因的CDS编码区序列，标记其起始密码子编码序列ATG和终止密码子编码序列TGA；2)选取包含CDS区的一段碱基序列，利用NCBIPrimer-BLAST设计引物，所设计的引物为：CPRF：ATGTCAGACAGCGCACAGGAC；CPRR：ACTCCATACATCTGCTGAATAT；CYP9F：ATGATACTAGTCCTGGTCTGGGT...
【专利技术属性】
技术研发人员：张文举，陈程，
申请(专利权)人：石河子大学，
类型：发明
国别省市：新疆,65
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。