一种胭脂萝卜花青苷生物合成调控基因RsAN1及其应用制造技术

技术编号:20612140 阅读:47 留言:0更新日期:2019-03-20 10:32
本发明专利技术公开了一种胭脂萝卜花青苷生物合成调控基因RsAN1及其应用,RsAN1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。RsAN1的表达量与胭脂萝卜花青苷含量正相关关系,通过对胭脂萝卜RsAN1基因的克隆、序列分析、表达分析和植株转染,得到瞬时超表达RsAN1的胭脂萝卜,其子叶和叶片中能合成和积累大量的花青苷,而野生型胭脂萝卜叶片和子叶并不能合成花青苷。通过基因的功能分析发现,在胭脂萝卜中单独过表达RsAN1基因后,能显著的提高花青苷的积累量。证明胭脂萝卜基因RsAN1是花青苷的正调控因子,为胭脂萝卜和其它植物的进一步改良提供优秀基因资源。为今后分子育种提供新的思路,为研究胭脂萝卜的品种培育等提供理论依据和材料。

An Anthocyanin Biosynthesis Regulating Gene RsAN1 of Carmine Radish and Its Application

The invention discloses a carmine radish anthocyanin biosynthesis regulatory gene RsAN1 and its application. The nucleotide sequence of RsAN1 is shown as SEQ ID NO.1, and the coding amino acid sequence is shown as SEQ ID NO.2. The expression level of RsAN1 was positively correlated with the anthocyanin content of carmine radish. Through cloning, sequence analysis, expression analysis and plant transfection of RsAN1 gene, a carmine radish overexpressing RsAN1 was obtained. A large amount of anthocyanin could be synthesized and accumulated in cotyledons and leaves of carmine radish, while anthocyanin could not be synthesized in leaves and cotyledons of wild carmine radish. Through functional analysis of the gene, it was found that overexpression of RsAN1 gene alone in carmine radish could significantly increase the accumulation of anthocyanin. It was proved that the carmine radish gene RsAN1 was a positive regulator of anthocyanin and provided excellent genetic resources for further improvement of carmine radish and other plants. To provide new ideas for molecular breeding in the future, and provide theoretical basis and materials for the study of carmine radish breeding.

【技术实现步骤摘要】
一种胭脂萝卜花青苷生物合成调控基因RsAN1及其应用
本专利技术属于植物基因工程
,具体涉及一种胭脂萝卜花青苷生物合成调控基因RsAN1及其应用。
技术介绍
胭脂萝卜也称红心萝卜,是重庆市涪陵区的特色一个地方品种,由于其肉质根从表皮到内部通红,含有丰富的花青苷而闻名。其肉质酥脆,适宜加工各种萝卜制品,用做泡菜久泡不烂,鲜红嫩脆。重庆的涪陵、武隆、南川等县是胭脂萝卜的主要产区,已有100余年的种植历史。胭脂萝卜相对其他红心萝卜品种花青苷含量高,在重庆地区,常从胭脂萝卜中提取花青苷作为天然着色剂。但是其他省、市引种,由于土壤、气候原因,效果均不佳。由于影响其积累花青素的机制还不清楚,极大地限制了胭脂萝卜的生产及推广。前期研究表明,植物花青素的生物合成调控主要在转录水平,MYB和bHLH转录因子对花青素生物合成起着非常重要的调控作用,影响着花青素的积累水平。胭脂萝卜花青素的大量积累是否也受到这两类转录因子的调控,目前还不清楚。国内外的研究表明,花青苷合成主要通过调控花青苷合成代谢过程中结构基因的表达,从而使合成代谢过程中的酶的合成受到影响。目前已经被公认的有三类调节花青苷合成的转录因子,分别是R2R3-MYB、bHLH(basicHlix-Loop-Hlix)和WD40,它们相互作用共同调节着花青苷的生物合成。植物的MYB转录因子是一个非常大的家族,它们调控着植物的次生代谢过程。MYB类转录因子以其结构上都有一段保守的DNA结合区结构域而得名。以DBD(DNABindingDomain)最为保守,一般包含1-3个不完全重复序列R(Repeat),每个重复片段R由51-52个保守的氨基酸残基和间隔序列组成。在R3区域包含有一个典型的结构域[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R,被称为bHLHMotif,它是能与bHLH一类蛋白相互作用的区域;C端有一个motif6的结构域[R/K]Px[P/A/R]xx[F/Y]。拟南芥中至少有154个MYB组成庞大的转录因子家族,这个家族由25个亚族组成。这些转录因子在调控次生代谢,控制细胞形态,介导病原抗性,应答激素信号等方面有十分重要的作用,参与拟南芥花青苷生物合成转录调控的PAP1和PAP2属于第6亚族。近来研究显示参与花青苷合成转录调控相关的MYB主要属于R2R3-MYB类。虽然前人也有报道红萝卜中花青苷生物合成相关的调控基因MYB,但是一般情况下均是在烟草拟南芥等模式植物中表达分析基因的功能,且单独表达MYB基因时花青苷积累量不大。至今还未有胭脂萝卜中花青苷生物合成调控基因的相关报道。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述不足,本专利技术的目的在于提供了一种胭脂萝卜花青苷生物合成调控基因RsAN1(Anthocyanin1)及其应用,提供了胭脂萝卜中花青苷含量调控的关键基因,为胭脂萝卜积累大量花青苷的遗传改造提供了新的基因资源。为实现上述目的,本专利技术采用如下技术方案:一种胭脂萝卜花青苷生物合成调控基因RsAN1,其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示;其编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。一种重组表达载体,其特征在于,包括所述的RsAN1的核苷酸序列。一种包含所述重组表达载体的植物细胞系或植物转化体。所述基因RsAN1在调控草本植物花青苷合成中的应用。一种高含量花青苷胭脂萝卜的培育方法,包括以下步骤:1)取胭脂萝卜肉质根提取总RNA,再以总RNA为模板通过反转录合成第一链cDNA;2)以步骤1)得到的cDNA为模板,以SEQIDNO3和SEQIDNO4所示核苷酸序列为引物进行扩增,得到的PCR扩增产物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示,并将PCR扩增产物连入表达载体中构建重组表达载体;3)将构建的重组表达载体转化至农杆菌GV3101后,再用所述农杆菌GV3101对胭脂萝卜进行侵染转化后,培养4~5天,即得到高含量花青苷胭脂萝卜。进一步,所述表达载体为pEAQ-HT。相比现有技术,本专利技术具有如下有益效果:1、本专利技术首次鉴定了胭脂萝卜中花青苷生物合成的关键MYB转录因子RsAN1,RsAN1的表达量与胭脂萝卜花青苷含量成正相关关系。证明胭脂萝卜基因RsAN1是花青苷的正调控因子,为胭脂萝卜和其它植物的进一步改良提供优秀基因资源。2、本专利技术通过对胭脂萝卜RsAN1基因的克隆、序列分析和植株转染,得到瞬时超表达RsAN1的胭脂萝卜,4~5天后其叶片和子叶中均能合成和积累大量花青苷,而野生型的胭脂萝卜叶片和子叶并不能合成花青苷。说明在胭脂萝卜中单独过表达RsAN1基因后,能显著的提高花青苷的积累量。为研究胭脂萝卜的品种培育等提供理论依据和材料。并且本专利技术中RsAN1基因普遍适用于草本植物,为调控草本植物的花青苷提供了一种有效的技术手段,具有广泛的应用价值。附图说明图1为PCR扩增得到RsAN1片段的电泳图;M为DNAMarker;A为RsAN1基因开放阅读框片段;图2为胭脂萝卜RsAN1推导的氨基酸序列的结构分析图;图3为胭脂萝卜RsAN1的氨基酸序列与其它植物的MYB蛋白的进化分析图;图4为RsAN1在野生型胭脂萝卜植株在不同部位的表达水平;图5为胭脂萝卜叶片和子叶上花青苷的含量;A和C为瞬时转化RsAN1的子叶和叶片,B和D为阴性对照组的子叶和叶片。具体实施方式下面结合具体实施例和附图对本专利技术作进一步详细说明。实施例中所述的实验方法无特别说明,即按常规分子生物学实验方法操作。下述实施例中所采用的胭脂萝卜‘红心1号’,由重庆市涪陵绿原农业科技发展公司提供;大肠杆菌DH5α和农杆菌GV3101从上海唯地生物技术有限公司购买,表达载体pEAQ-HT为实验室保存。1×TBE缓冲液、6×loadingbuffer、GoldviewTM核酸染料、RNase抑制剂、dNTPMix、AMV反转录酶、MgCl2、DNA聚合酶和琼脂糖购自上海生物工程有限公司。所用其他原料如无特殊说明,即为普通市售。实施例1胭脂萝卜基因RsAN1的克隆及表达载体构建(1)胭脂萝卜总RNA的提取及检测胭脂萝卜总RNA的提取采用北京艾德莱生物科技有限公司植物RNA提取试剂盒(具体方法参照说明书)。用DNaseI(TaKaRa)处理总RNA中残留的DNA,具体方法参照说明书。用核酸蛋白仪上测定RNA的浓度测定和纯度。吸取2μLRNA在1.5%琼脂糖凝胶电泳上进行检测,提取的RNA的OD260/OD280的比值均介于1.80~2.00,完整性较好,可以用于反转录。(2)第一链cDNA的合成以提取胭脂萝卜的总RNA为模板,利用MLV-ReverseTranscriptase试剂盒(Invitrogen公司)合成cDNA第一链,具体操作均按试剂盒说明书进行。在离心管中配制按照下列模板RNA/引物的顺序配制混合物(6μL):模板RNA2μL,Oligo(dT)Primer3μL,RNase-freeddH2O1μL。在PCR仪上,70℃保温10min,后迅速将其置于冰上急速冷却2min以上。离心数秒,得到模板RNA/引物的变性溶液。配制反转录反应液(10μL):模板RNA/引物的变性溶液6μL,5×M-MLVBuffer2μL,dNTPMixture(10mM)0.5μL,RNaseInhibitor本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种胭脂萝卜花青苷生物合成调控基因RsAN1,其特征在于,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种胭脂萝卜花青苷生物合成调控基因RsAN1,其特征在于,其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述胭脂萝卜花青苷生物合成调控基因RsAN1,其编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.一种重组表达载体,其特征在于,包括权利要求1所述的RsAN1的核苷酸序列。4.一种包含权利要求3所述重组表达载体的植物细胞系或植物转化体。5.如权利要求1所述基因在调控草本植物花青苷合成中的应用。6.一种高含量花青苷胭脂萝卜的培育方法,其特征在于,包括以下步骤:1)取胭脂萝卜肉质根提取总RN...

【专利技术属性】
技术研发人员:赖彪杜丽娜程元艺刘红黄杰王琪王春兰
申请(专利权)人:长江师范学院
类型:发明
国别省市:重庆,50

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