生成用于大规模平行测序的DNA文库的方法和试剂盒技术

公开了产生大规模平行测序文库的方法，包括以下步骤：a)提供基本WGA DNA文库(pWGAlib)，包括含有WGA文库通用序列衔接子的片段；b)使用至少一种第一引物(1PR)和至少一种第二引物(2PR)再扩增基本WGA DNA文库；所述至少一种第一引物(1PR)从5'至3'包含至少一个第一测序衔接子(1PR5SA)、至少一个第一测序条形码(1PR5BC)和第一引物3'区段(1PR3S)，所述第一引物3'区段(1PR3S)与WGA文库通用序列衔接子或其反向互补序列杂交；所述至少一个第二引物(2PR)从5'至3'包含不同于至少一个第一测序衔接子(1PR5SA)的至少一个第二测序衔接子(2PR5SA)和第二引物3'区段(2PR3S)，所述第二引物3'区段(2PR3S)与WGA文库通用序列衔接子或其反向互补序列杂交。

Methods and kits for generating DNA libraries for large-scale parallel sequencing

A method for generating large-scale parallel sequencing libraries is disclosed, including the following steps: a) providing basic WGA DNA libraries (pWGAlib), including fragments containing universal sequence linkers of WGA libraries; b) amplifying basic WGA DNA libraries using at least one first primer (1PR) and at least one second primer (2PR); and at least one of the first primers (1PR) containing at least one first sequencing link from 5'to 3' Connector (1PR5SA), at least one first sequencing bar code (1PR5BC) and the first primer 3'segment (1PR3S), the first primer 3'segment (1PR3S) is hybridized with WGA library universal sequence linker or its reverse complementary sequence; the at least one second primer (2PR) contains at least one second sequencing linker (2PR5SA) different from at least one first sequencing linker (1PR5SA) and the second primer. Object 3'segment (2PR3S), the second primer 3' segment (2PR3S) is hybridized with the universal sequence linker of the WGA library or its reverse complementary sequence.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生成用于大规模平行测序的DNA文库的方法和试剂盒
本专利技术涉及从全基因组扩增产物(WGA)生成用于全基因组测序的大规模平行测序文库的方法和试剂盒。特别地，该方法还可以应用于确定性限制性位点(DeterministicRestriction-Site)，全基因组扩增(DRS-WGA)DNA产物。该文库可有利地用于低通全基因组测序和全基因组拷贝数分析(genome-widecopy-numberprofiling)。
技术介绍
对于单细胞，为了获得更多DNA以简化和/或使得可以进行不同类型的遗传分析(包括测序、SNP检测等)，进行全基因组扩增(WGA)是有用的。使用基于确定性限制性位点的LM-PCR(例如WO/2000/017390中所述)进行的WGA是本领域已知的(下文中简称为DRS-WGA)。已经证明DRS-WGA是用于扩增单细胞的更好的方案(参考：LeeYS等人:基于微阵列的比较基因组杂交与用于进一步定量分析的全基因组扩增方法的比较(Comparisonofwholegenomeamplificationmethodsforfurtherquantitativeanalysiswithmicroarray-basedcomparativegenomichybridization).TaiwanJObstetGynecol.2008,47(1):32-41.)并且由于修复而对DNA降解更具可恢复性(参考StoeckleinNH等人：由于来自显微切割标本的微量DNA的全局扩增，SCOMP优于退化的寡核苷酸引发PCR(SCOMPisSuperiortoDegeneratedOligonucleotidePrimed-PCRforGlobalAmplificationofMinuteAmountsofDNAfromMicrodissectedArchivalSamples).美国病理学期刊2002,Vol.161,No.1)。基于LM-PCR的DRS-WGA商业试剂盒(Ampli1TMWGA试剂盒，SiliconBiosystems)已经在HodgkinsonC.L.等人,小细胞肺癌中循环肿瘤细胞的肿瘤发生和遗传谱分析(Tumorigenicityandgeneticprofilingofcirculatingtumorcellsinsmall-celllungcancer),自然医学20,897–903(2014)中使用。在这项工作中，进行了对单细胞WGA材料的低通全基因组测序的拷贝数分析。然而，对于该论文中使用的标准工作流程，Illumina文库的创建需要几个步骤，包括i)消化WGA衔接子，ii)DNA片段化，以及标准Illumina工作流程步骤例如iii)末端修复、iv)加A尾、v)条形码化衔接子连接，加上常规步骤：vi)条形码化NGS文库的样品池化和vii)测序。如上述文献(图5b)中所示，尽管CTC通常显示出更多的畸变，但WBC确实呈现了少量可推测为假阳性的拷贝数调用(copy-numbercalls)。Ampli1TMWGA与阵列比较基因组杂交(aCGH)兼容；确实有几组(MoehlendickB等人.(2013)使用寡核苷酸阵列CGH分析单细胞中小于100kb的拷贝数改变的稳健方法(ARobustMethodtoAnalyzeCopyNumberAlterationsofLessthan100kbinSingleCellsUsingOligonucleotideArrayCGH).PLoSONE8(6):e67031；CzyzZT等人(2014)用于临床样品的可靠的单细胞阵列CGH(ReliableSingleCellArrayCGHforClinicalSamples).PLoSONE9(1):e85907)表明它适用于高分辨率拷贝数分析。然而，aCGH技术昂贵且劳动强度大，因此可能需要不同的方法，例如用于检测体细胞拷贝数改变(CNA)的低通全基因组测序(LPWGS)。Baslan等人(优化单细胞的稀疏测序用于高度多重拷贝数分析(Optimizingsparsesequencingofsinglecellsforhighlymultiplexcopynumberprofiling),基因组研究,25:1-11,April9,2015)从DOP-PCR全基因组扩增开始使用几个酶促步骤实现全基因组拷贝数分析，所述酶促步骤包括WGA衔接子消化、Illumina衔接子的连接、PCR扩增。Yan等人ProcNatlAcadSciUSA.2015Dec29；112(52):15964-9，教导使用MALBACWGA(YikonGenomicsInc)，用于对染色体异常和单基因疾病同时预植入前遗传诊断。US8206913B1(Kamberov等，RubiconGenomics)教导了采用特别的简并-寡核苷酸-引发-PCR(DOP-PCR)的方法。该参考文献还包含不同WGA方法和对现有技术的概述。US8206913B1是商业试剂盒PicoPlex的基础。Hou等人,用于单细胞重测序的全基因组扩增方法之间的变异检测比较(Comparisonofvariationsdetectionbetweenwhole-genomeamplificationmethodsusedinsingle-cellresequencing,GigaScience)(2015)4:37，报道了包括MALBAC和多位移扩增(MDA)的几种WGA方法的性能比较。该论文中使用LPWGS和WGS。用工作流程获得文库制备。当使用阵列CGH(比较基因组杂交)、中期CGH以及其他遗传分析测定(如杂合性缺失)时，DRS-WGA已显示比DOP-PCR更好地分析来自微量显微切割的FFPE材料的拷贝数谱(Stoecklein等人，由于来自显微切割标本的微量DNA的全局扩增，SCOMP优于退化的寡核苷酸引发PCR(SCOMPisSuperiortoDegeneratedOligonucleotidePrimed-PCRforGlobalAmplificationofMinuteAmountsofDNAfromMicrodissectedArchivalSamples)，AmJPathol.2002Jul；161(1):43-51；Arneson等人，用于分析提取自福尔马林固定石蜡包埋组织中显微切割早期乳房病变的DNA的全基因组扩增方法的比较(ComparisonofwholegenomeamplificationmethodsforanalysisofDNAextractedfrommicrodissectedearlybreastlesionsinformalin-fixedparaffin-embeddedtissue),ISRNOncol.2012；2012:710692.doi:10.5402/2012/710692.Epub2012Mar14.)。WO2014068519(Fontana等人)教导了用于从突变引入、去除或改变限制性位点的基因座中的DRS-WGA产物检测突变的方法。WO2015083121A1(Klein等人)教导了通本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生成大规模平行测序文库的方法，包括以下步骤：a.提供基本WGA DNA文库(pWGAlib)，所述基本WGA DNA文库(pWGAlib)包括含有已知的5'序列区段(5SS)、中间序列区段(MSS)和与已知的5'序列区段反向互补的已知的3'序列区段(3SS)的片段，所述已知的5'序列区段(5SS)包含WGA文库通用序列衔接子，所述中间序列区段(MSS)至少包含插入区段(IS)，所述插入区段(IS)与WGA之前的原始未扩增DNA的DNA序列对应，所述中间序列任选地另外包含侧翼5'中间区段(F5)和/或侧翼3'中间区段(F3)；b.使用至少一种第一引物(1PR)和至少一种第二引物(2PR)再扩增基本WGA DNA文库；其中，所述至少一种第一引物(1PR)包含第一引物5'区段(1PR5S)和第一引物3'区段(1PR3S)，所述第一引物5'区段(1PR5S)包含位于至少一个第一测序衔接子(1PR5SA)的3'位置和所述第一引物3'区段(1PR3S)的5'位置的至少一个第一测序衔接子(1PR5SA)和至少一个第一测序条形码(1PR5BC)，所述第一引物3'区段(1PR3S)与所述已知的5'序列区段(5SS)或所述已知的3'序列区段(3SS)杂交；所述至少一种第二引物(2PR)包含第二引物5'区段(2PR5S)和第二引物3'区段(2PR3S)，所述第二引物5'区段(2PR5S)包含不同于所述至少一个第一测序衔接子(1PR5SA)的至少一个第二测序衔接子(2PR5SA)，所述第二引物3'区段(2PR3S)与所述已知的5'序列区段(5SS)或所述已知的3'序列区段(3SS)杂交。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.04.15 IT 1020160000391541.一种生成大规模平行测序文库的方法，包括以下步骤：a.提供基本WGADNA文库(pWGAlib)，所述基本WGADNA文库(pWGAlib)包括含有已知的5'序列区段(5SS)、中间序列区段(MSS)和与已知的5'序列区段反向互补的已知的3'序列区段(3SS)的片段，所述已知的5'序列区段(5SS)包含WGA文库通用序列衔接子，所述中间序列区段(MSS)至少包含插入区段(IS)，所述插入区段(IS)与WGA之前的原始未扩增DNA的DNA序列对应，所述中间序列任选地另外包含侧翼5'中间区段(F5)和/或侧翼3'中间区段(F3)；b.使用至少一种第一引物(1PR)和至少一种第二引物(2PR)再扩增基本WGADNA文库；其中，所述至少一种第一引物(1PR)包含第一引物5'区段(1PR5S)和第一引物3'区段(1PR3S)，所述第一引物5'区段(1PR5S)包含位于至少一个第一测序衔接子(1PR5SA)的3'位置和所述第一引物3'区段(1PR3S)的5'位置的至少一个第一测序衔接子(1PR5SA)和至少一个第一测序条形码(1PR5BC)，所述第一引物3'区段(1PR3S)与所述已知的5'序列区段(5SS)或所述已知的3'序列区段(3SS)杂交；所述至少一种第二引物(2PR)包含第二引物5'区段(2PR5S)和第二引物3'区段(2PR3S)，所述第二引物5'区段(2PR5S)包含不同于所述至少一个第一测序衔接子(1PR5SA)的至少一个第二测序衔接子(2PR5SA)，所述第二引物3'区段(2PR3S)与所述已知的5'序列区段(5SS)或所述已知的3'序列区段(3SS)杂交。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第二引物(2PR)还包含位于所述至少一个第二测序衔接子(2PR5SA)的3'位置和所述第二引物3'区段(2PR3S)的5'位置的至少一个第二测序条形码(2PR5BC)。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述WGA文库通用序列衔接子是DRS-WGA文库通用序列衔接子或MALBAC文库通用序列衔接子。4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述WGA文库通用序列衔接子是DRS-WGA文库通用序列衔接子。5.根据权利要求3或4所述的方法，其中，所述DRS-WGA文库通用序列衔接子是SEQIDNO：282，并且所述MALBAC文库通用序列衔接子是SEQIDNO：283(MALBAC)。6.一种低通全基因组测序的方法，包括以下步骤：c.提供多个根据权利要求1至5中任一项所述的方法获得的条形码化的大规模平行测序文库，并且使用不同测序条形码(BC)池化获得的样品；d.对池化的文库进行测序。7.根据权利要求6所述的低通全基因组测序的方法，其中，使用不同测序条形码(BC)池化样品的步骤还包括以下步骤：e)对每个所述条形码化的大规模平行测序文库中的DNA进行定量；f)使条形码化的大规模平行测序文库的量标准化。8.根据权利要求7所述的低通全基因组测序的方法，其中，使用不同测序条形码(BC)池化样品的步骤还包括选择具有至少一个选定的碱基对的范围的DNA片段的步骤。9.根据权利要求8所述的低通全基因组测序的方法，其中，所述碱基对的范围集中于650bp。10.根据权利要求8所述的低通全基因组测序的方法，其中，所述碱基对的范围集中于400bp。11.根据权利要求8所述的低通全基因组测序的方法，其中，所述碱基对的范围集中于200bp。12.根据权利要求8所述的低通全基因组测序的方法，其中，所述碱基对的范围集中于150bp。13.根据权利要求8所述的低通全基因组测序的方法，其中，所述碱基对的范围集中于100bp。14.根据权利要求8所述的低通全基因组测序的方法，其中，所述碱基对的范围集中于50bp。15.根据权利要求8至14中任一项所述的低通全基因组测序的方法，还包括选择包含所述第一测序衔接子和所述第二测序衔接子的DNA片段的步骤。16.根据权利要求15所述的低通全基因组测序的方法，其中，所述选择包含所述第一测序衔接子和所述第二测序衔接子的DNA片段的步骤通过使大规模平行测序文库与至少一种固相接触来进行。17.根据权利要求16所述的低通全基因组测序的方法，其中，所述至少一种固相包含功能化的顺磁珠。18.根据权利要求17所述的低通全基因组测序的方法，其中，所述顺磁珠用链霉亲和素包被而功能化。19.根据权利要求18所述的低通全基因组测序的方法，其中，所述至少一种第一引物(1P...

【专利技术属性】
技术研发人员：尼科洛·马纳雷西，热尼·布松，保拉·托诺尼，
申请(专利权)人：美纳里尼硅生物系统股份公司，
类型：发明
国别省市：意大利,IT