一种基因敲除选育pdlim5b基因缺失型斑马鱼的方法技术

本发明专利技术涉及基因敲除技术领域，特别是公开了一种基因敲除选育pdlim5b基因缺失型斑马鱼的方法，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在斑马鱼的pdlim5b基因上设计合适的打靶位点，在体外合成的特异性gRNA和Cas9‑蛋白，显微共注射进入斑马鱼一细胞内，+胚胎培养48h后，通过选取胚胎进行基因型分析，从而证实了所选位点的有效性。本发明专利技术能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基因，且制作简单、成本低，且可同时对靶基因上多个位点进行剪切，沉默任意数目的单个基因。且干扰掉pdlim5b基因斑马鱼胚胎出现明显的发育畸形。

A Method for Breeding Zebrafish with pdlim5b Gene Deletion by Gene Knockout

The invention relates to the field of gene knockout technology, in particular to a method for breeding zebrafish with pdlim5b gene deletion by gene knockout. Through CRISPR/Cas9 gene editing technology, suitable target sites are designed on the pdlim5b gene of zebrafish, specific gRNA and Cas9 protein synthesized in vitro are injected into a cell of zebrafish by microinjection, and after 48 hours of embryo culture, the target sites are designed. The genotype analysis of the selected embryos confirmed the validity of the selected loci. The invention can silence specific genes more efficiently and accurately in the genome of an organism, and has the advantages of simple fabrication, low cost, and multiple loci on the target gene can be cut at the same time to silence any number of single genes. Moreover, zebrafish embryos with pdlim5b gene interference showed obvious developmental abnormalities.

【技术实现步骤摘要】
一种基因敲除选育pdlim5b基因缺失型斑马鱼的方法
本专利技术涉及基因敲除领域，特别是公开了一种基因敲除选育pdlim5b基因缺失型斑马鱼的方法。
技术介绍
pdlim5b（PDZandLIMdomain5b）基因位于斑马鱼第10号染色体上，包含17个外显子和16个内含子，cDNA全长1887bp，编码628个氨基酸，pdlim5b包含有9个进化上保守的功能结构域，同时通过基因差异表达谱分析和基因组关联分析等，发现pdlim5（pdlim5b在人类中的同源基因）在人类胚胎早期的多个组织中都有表达，特别是心脏中强烈表达。
技术实现思路
斑马鱼与人类心脏发育过程中的基因、信号通路有高度同源性，且pdlim5b基因进化上较为保守，研究发现pdlim5b在斑马鱼胚胎早期表达量特别高。而且，与其他动物模型相比，斑马鱼具有个体小、易于饲养、发育快、繁殖能力强、体外受精、胚胎体外发育且透明等优点。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在斑马鱼的pdlim5b基因上设计合适的打靶位点，在体外合成的特异性gRNA（终浓度20ng/μL）和Cas9蛋白（终浓度5μg/μL），显微共注射进入斑马鱼一细胞内，胚胎培养48h后，通过选取胚胎进行基因型分析，鉴定所设打靶位点的有效性。基因打靶技术起源于20世纪80年代末，是一种通过对基因组进行定点修饰来研究基因功能的重要方法手段，也可用于治疗人类的各种遗传性疾病。该技术主要是利用缺失突变、基因灭活、染色体大片段删除以及外源基因导入等方式来改变生物的遗传信息，并且在生殖系中稳定遗传后表达突变性状，从而研究生物体内特定基因在生长发育过程中的作用，所以这类技术手段已成为现代分子生物学研究热点。传统的基因打靶技术是建立在胚胎干细胞(ESC)和同源重组技术的基础之上，故打靶技术效率极低。2013年初，一种全新的人工核酸内切酶clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9，能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基因，且制作简单、成本低，且可同时对靶基因上多个位点进行剪切，沉默任意数目的单个基因，但同时该技术存在一定的缺陷，其脱靶率相对较高。
技术实现思路
本专利技术为了克服上述技术问题的不足，提供了一种基因敲除选育pdlim5b基因缺失型斑马鱼的方法，找到了合适的打靶位点，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，选育出pdlim5b基因缺失型斑马鱼解决上述技术问题的技术方案如下：1）设计CRISPR/Cas9基因敲除靶位点和检测引物在NationalCenterforBiotechnologyInformation（NCBI）上查询斑马鱼pdlim5b基因的基因组DNA序列，在网站SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)上分析其功能结构域，根据CRISPR/Cas敲除原理，在网站TheZiFiTTargeter(http://zifit.partners.org/ZiFiT/)上设计pdlim5b基因的靶位点。靶点的选择必须遵循此标准：5’-GG-(N)18-NGG-3’。其中5’端的GG二核苷酸是T7启动子的一部分，设计靶位点时可以不受此限制，但是必须保证靶位点的3’端是NGG。靶点的选择位置必须在基因的结构域内，以确保靶位点碱基的插入或者缺失可以影响pdlim5b基因的整个结构域，从而来改变基因的表达两对特异性靶位点PCR引物如下：两对特异性靶位点PCR引物如下：F1（靶位点a正向引物）：tgtaatacgactcactataggagatcagtgttggtgatggttttagagctagaaatagcR（共用的反向引物）：aagcaccgactcggtgccactF2（靶位点b正向引物）tgtaatacgactcactataggaagatcaaagcctgcagcgttttagagctagaaatagcR（共用的反向引物）：aagcaccgactcggtgccactPCR检测引物上下游引物分别位于2号内含子以及3号内含子上：F(5’-agactccacccactcaactg-3’)R(5’-cactaaacacagcgcagaca-3’）2）构建gRNA表达载体以及gRNA体外合成a，首先将gRNA骨架克隆到p42250载体上，取1-2μL质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测b，特异性gRNA体外合成用BsaI限制性内切酶线性化此质粒。一般来说，酶切反应总体积为20μL，体系如下：p42250载体6μL10×Buffer2μLBsaI限制性内切酶1μLddH2O11μL总体积20μL混匀后于37℃水浴，酶切2.5h以上c，以线性化的p42250载体为模板，通过下面特异性引物进行PCR，扩增出用于特异性gRNA合成的双链DNA正向特异性靶位点引物F1或F2：T7启动子+20pb靶序列+20bpsgRNA上游骨架；反向引物R：20bpsgRNA下游骨架PCR反应体系（50μL）如下：模板（p42250载体）0.5μLPrimerF1（或F2，10uM）2μLPrimerR（10uM）2μL2×Buffer（含20mMMg2+）25μLdNTPmix（10mM）1μLEx-TaqDNA聚合酶1μLddH2O18.5μL总体积50μL震荡混匀之后，4℃离心，于PCR仪上进行扩增反应。反应条件为：预变性95℃5min，（变性95℃30s，退火60℃30s，延伸72℃30s)30个循环，再72℃8min。待反应结束后，离心PCR产物，取1μL样品点样于1.3%琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统拍摄结果d，检测确定条带正确之后，进行琼脂糖凝胶DNA回收，纯化回收PCR产物e,测定纯化的DNA浓度（尽量达到1μg），再以此DNA为模板，用20μL体系进行体外转录，合成特异性gRNA。转录实验中所用Tip头，EP管均为DEPC处理过的RNase-Free产品，具体操作如下：体外转录反应体系（20μL）：模板DNA12μL10×Buffer2μLrNTPmix（10mM）4μLT7RNA聚合酶2μLNuclease-FreeWater0μL总体积20μL将反应物都加入0.2mLRNase-Free的EP管中，混匀之后，于37℃水浴2.5h；水浴结束后，向转录体系中加入1μLDNA酶，放置于37℃水浴锅中反应30min，以消化DNA模板，然后取1μL样品，用配制好的1.3%的琼脂糖凝胶进行电泳，以检测转录结果，若转录产物大小与预期的相符，则说明转录成功；f，特异性gRNA的纯化用RNeasyMinikit试剂盒纯化转录成功的gRNA，保存于-20℃。吸取纯化后的gRNA溶液1μL进行琼脂糖凝胶电泳，以检验纯化产物，并测定纯化之后的gRNA浓度3）斑马鱼胚胎的显微注射在受精后30min之内，用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中在进行显微注射之前，将Cas9蛋白和gRNA配成混合液，充分混匀，使Cas9蛋白的终浓度为5μg/μL，gRNA的终浓度为20ng/μL。注射约3μLCas9蛋白和gRNA混合液于一细胞期的受精卵内。注射过的受精卵放置本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基因敲除选育pdlim5b基因缺失型斑马鱼的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）分别设计CRISPR/Cas9基因敲除靶位点和检测引物在National Center for Biotechnology Information（NCBI）上查询斑马鱼pdlim5b基因的基因组DNA序列，在网站SMART（http://smart.embl‑heidelberg.de/）上分析其功能结构域，根据CRISPR/Cas9敲除原理，在网站The ZiFiT Targeter (http://zifit.partners.org/ZiFiT/) 上设计pdlim5b基因的靶位点；两对特异性靶位点PCR 引物如下：F1（靶位点a正向引物）：tgtaatacgactcactata ggagatcagtgttggtgatg gttttagagctagaaatagcR（共用的反向引物）：aagcaccgactcggtgccactF2（靶位点b正向引物）tgtaatacgactcactata ggaagatcaaagcctgcagc gttttagagctagaaatagcR（共用的反向引物）：aagcaccgactcggtgccactPCR检测引物上下游引物分别位于2号内含子以及3号内含子上：F (5’‑agactccacccactcaactg‑3’)R (5’‑cactaaacacagcgcagaca‑3’）2）构建gRNA表达载体以及特异性gRNA体外合成a，首先将gRNA骨架克隆到p42250载体上；b，特异性gRNA体外合成用BsaI限制性内切酶线性化此质粒；酶切反应总体积为20μL，体系如下：p42250载体            6μL10× Buffer           2μLBsaI限制性内切酶      1μLddH2O                 11μL总体积                20μL混匀后于37 ℃水浴，酶切2h以上；c,以线性化的p42250载体为模板，通过下面特异性引物进行PCR，扩增出用于特异性gRNA合成的双链DNA；正向特异性靶位点引物F1或F2：T7启动子+20pb靶序列+20bp sgRNA上游骨架，反向引物R：20bp sgRNA下游骨架，PCR反应体系如下：模板（p42250载体）              0.5 μLPrimer F1（10 uM）              2 μLPrimer R（10 uM）               2 μL2× Buffer（含20mM Mg2+）       25 μLdNTP mix（10 mM）               1 μLEx‑Taq DNA聚合酶              1 μLddH2O                         18.5 μL总体积                        50 μL震荡混匀之后，4 ℃离心，于PCR仪上进行扩增反应；d，检测确定条带正确之后，进行琼脂糖凝胶DNA回收，纯化回收PCR产物；e，测定纯化的DNA浓度，再以此DNA为模板，用20 μL体系进行体外转录，合成特异性gRNA；具体操作如下：体外转录反应体系：模板DNA                   12 μL10×Buffer                2μLrNTP mix（10 mM）           4 μLT7 RNA聚合酶              2 μLNuclease‑Free Water       0 μL总体积                    20 μL将反应物全部加入1.5 mL EP管中，混匀之后，于37 ℃水浴2.5 h；水浴结束后，消化DNA模板，然后电泳；f，特异性gRNA的纯化用RNeasy Mini kit试剂盒纯化转录成功的gRNA，保存于‑20 ℃；进行琼脂糖凝胶电泳，以检验纯化产物，并测定纯化之后的gRNA浓度；3）斑马鱼胚胎的显微注射在受精后30 min 之内，用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中，在进行显微注射之前，将Cas9 蛋白和gRNA配成混合液，充分混匀，使Cas9 蛋白的终浓度为5μg/μL，gRNA 的终浓度为20 ng/μL，注射3μL Cas9 蛋白和gRNA混合液于一细胞期的受精卵内；注射过的受精卵放置于E3水中，28 ℃孵化；在体式显微镜下观察胚胎表型，筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析；显微注射体系如下：Cas9 蛋白        5μg/μLgRNA             20 ng/μLNuclease free H2OTotal            3μL；4）Sanger测序检测靶位...

【技术特征摘要】
1.一种基因敲除选育pdlim5b基因缺失型斑马鱼的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）分别设计CRISPR/Cas9基因敲除靶位点和检测引物在NationalCenterforBiotechnologyInformation（NCBI）上查询斑马鱼pdlim5b基因的基因组DNA序列，在网站SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）上分析其功能结构域，根据CRISPR/Cas9敲除原理，在网站TheZiFiTTargeter(http://zifit.partners.org/ZiFiT/)上设计pdlim5b基因的靶位点；两对特异性靶位点PCR引物如下：F1（靶位点a正向引物）：tgtaatacgactcactataggagatcagtgttggtgatggttttagagctagaaatagcR（共用的反向引物）：aagcaccgactcggtgccactF2（靶位点b正向引物）tgtaatacgactcactataggaagatcaaagcctgcagcgttttagagctagaaatagcR（共用的反向引物）：aagcaccgactcggtgccactPCR检测引物上下游引物分别位于2号内含子以及3号内含子上：F(5’-agactccacccactcaactg-3’)R(5’-cactaaacacagcgcagaca-3’）2）构建gRNA表达载体以及特异性gRNA体外合成a，首先将gRNA骨架克隆到p42250载体上；b，特异性gRNA体外合成用BsaI限制性内切酶线性化此质粒；酶切反应总体积为20μL，体系如下：p42250载体6μL10×Buffer2μLBsaI限制性内切酶1μLddH2O11μL总体积20μL混匀后于37℃水浴，酶切2h以上；c,以线性化的p42250载体为模板，通过下面特异性引物进行PCR，扩增出用于特异性gRNA合成的双链DNA；正向特异性靶位点引物F1或F2：T7启动子+20pb靶序列+20bpsgRNA上游骨架，反向引物R：20bpsgRNA下游骨架，PCR反应体系如下：模板（p42250载体）0.5μLPrimerF1（10uM）2μLPrimerR（10uM）2μL2×Buffer（含20mMMg2+）25μLdNTPmix（10mM）1μLEx-TaqDNA聚合酶1μLddH2O18.5μL总体积50μL震荡混匀之后，4℃离心，于PCR仪上进行扩增反应；d，检测确定条带正确之后，进行琼脂糖凝胶DNA回收，纯化回收PCR产物；e，测定纯化的DNA浓度，再以此DNA为模板，用20μL体系进行体外转录，合成特异性gRNA；具体操作如下：体外转录反应体系：模板DNA12μL10×Buffer2μLrNTPmix（10mM）4μLT7RNA聚合酶2μLNuclease-FreeWater0μL总体积20μL将反应物全部加入1.5mLEP管中，混匀之后，于37℃水浴2.5h；水浴结束后，消化DNA模板，然后电泳；f，特异性gRNA的纯化用RNeasyMinikit试剂盒纯化转录成功的gRNA，保存于-20℃；进行琼脂糖凝胶电泳，以检验纯化产物，并测定纯化之后的gRNA浓度；3）斑马鱼胚胎的显微注射在受精后30min之内，用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中，在进行显微注射之前，将Cas9蛋白和gRNA配成混合液，充分混匀，使Cas9蛋白的终浓度为5μg/μL，gRNA的终浓度为20ng/μL，注射3μLCas9蛋白和gRNA混合液于一细胞期的受精卵内；注射过的受精卵放置于E3水中，28℃孵化；在体式显微镜下观察胚胎表型，筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析；显微注射体系如下：Cas9蛋白5μg/μLgRNA20ng/μLNucleasefreeH2OTotal3μL；4）Sanger测序检测靶位点的有效性对斑马鱼胚胎进行显微注射之后，挑选部分发育正常的早期胚胎，检测其pdlim5b基因是否存在突变；a，提取斑马鱼基因组斑马鱼胚胎受精48小时...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓云，曾宇茜，刘乐，陈湘定，谢紫微，
申请(专利权)人：湖南师范大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43