本发明专利技术公开了一种羰基还原酶突变体mut‑AcCR(E144A/G152L)及其应用与编码基因。羰基还原酶AcCR能够催化多种潜手性羰基化合物不对称还原,但是其对于芳香族化合物的活性及底物耐受性较低,本发明专利技术采用酶分子改造手段将糖基化还原酶AcCR进行突变,获得突变体mut‑AcCR(E144A/G152L),该突变体对于4’‑氯苯乙酮的比酶活可达92.7 U/mg,比未突变前的羰基还原酶的比活力提高17.93倍。底物耐受浓度从50 mmol/L提高至200 mmol/L。本发明专利技术所述羰基还原酶突变体在羰基化合物的不对称还原中被广泛应用。
A Carbonyl Reductase Mut-AcCR (E144A/G152L) Mutant and Its Application and Coding Gene
The invention discloses a carbonyl reductase mut AcCR (E144A/G152L) mutant and its application and coding gene. Carbonyl reductase AcCR can catalyze asymmetric reduction of various latent chiral carbonyl compounds, but its activity and substrate tolerance to aromatic compounds are low. The mutant mut AcCR (E144A/G152L) was obtained by mutagenesis of glycosylation reductase AcCR by enzymatic molecular modification. The specific enzyme activity of the mutant for 4'chloroacetophenone reached 92.7 U/mg, which is higher than that of the mutant before mutation. The specific activity of carbonyl reductase increased by 17.93 times. Substrate tolerance increased from 50 mmol/L to 200 mmol/L. The carbonyl reductase mutant of the invention is widely used in asymmetric reduction of carbonyl compounds.
【技术实现步骤摘要】
一种羰基还原酶突变体mut-AcCR(E144A/G152L)及其应用与编码基因
本专利技术属于酶分子改造领域,具体涉及一种羰基还原酶突变体mut-AcCR(E144A/G152L)及其应用与编码该突变体的基因。
技术介绍
光学纯的手性醇及其衍生物是合成手性药物、液晶材料、香精香料、农药的重要手性中间体,在医药及其他化工领域占有重要位置。手性醇可以通过化学法和和生物法合成。化学合成法一般需要高温高压等严苛的条件;采用大量的有机试剂,环境污染严重;制备过程复杂,往往存在多次保护和去保护步骤;更重要的是化学方法得到的产物的对映体选择性低。相比于化学法,生物法一般在常温常压下反应,条件温和,设备要求低,环境污染小,底物专一性强,具有较高的立体选择性和区域选择性,产物对映体纯度高等优点。生物催化合成手性醇正在以强劲的势头在制备药物中间体中发挥越来越重要的作用。基于绿色化学和可持续发展的原则,生物催化制备手性醇是既绿色又可持续的合成途径。羰基还原酶作为一种高效、高选择性的可用于不对称还原反应的生物催化剂,常用于制备具有光学活性的手性化合物。羰基还原酶在催化不对称还原反应时存在两个极具挑战性的问题,并且限制其进一步应用于不对称合成反应。第一,很多高价值手性醇的潜手性底物的溶解性很低或不可溶于酶的天然介质。这个缺点可以通过采用非水介质提高底物溶解度的方法得以解决,如采用有机溶剂、离子液体、超临界二氧化碳等单或双相反应介质进行生物催化反应。一部分羰基还原酶以这些溶剂为介质,在高底物浓度时亦表现出较高的酶活。但是,一些羰基还原酶的活性、选择性和稳定性在非水介质中往往会出现不同程度的降低。因此,在选择羰基还原酶非水反应介质时需要对反应介质进行筛选。第二,由于羰基还原酶具有严格的底物特异性、辅酶依赖性以及生理环境的不适应等特点,使羰基还原酶并非总能有效地完成一个特定的立体专一性合成反应,如在高浓度底物、高温、极端pH等环境下,羰基还原酶往往表现出活性低、选择性和稳定性差等不足。随着基因组学和蛋白质组学的发展,科学家将更多的目光投入到蛋白质工程上。以定向进化和理性设计等为基础,对蛋白序列进行修饰,改变其结构,进而影响其催化性能,使其具有更好的区域和立体选择性、更高的稳定性和底物耐受性,为手性醇的合成提供更有效的方式。将蛋白质工程更好地应用于酶分子改造,可以使以酶或细胞为主导的生物催化在底物、介质、反应器等其他方面得到进一步的发展,使蛋白质工程取得的成果得到更有效、更持续性地应用。本专利技术前期研究中,从醋酸杆菌Acetobactersp.CCTCCM209061中克隆表达一种羰基还原酶。该羰基还原酶能够催化多种底物进行不对称还原反应,具有良好的立体选择性。但是,该羰基还原酶对于4’-氯苯乙酮等芳香族羰基化合物的酶活较低,对于这类底物的耐受性比较差,只有在底物浓度较低时才能达到良好的催化效果。
技术实现思路
为了克服该酶活力低及底物耐受性差的缺点,本专利技术的首要目的在于提供一种活性和底物耐受性有明显提高的遵循反-Prelog规则的羰基还原酶突变体mut-AcCR(E144A/G152L)。本专利技术的另一个目的在于提供上述羰基还原酶突变体mut-AcCR(E144A/G152L)的基因及氨基酸序列。本专利技术的再一个目的在于提供上述羰基还原酶突变体mut-AcCR(E144A/G152L)的应用。本专利技术的目的通过以下技术方案实现。一种羰基还原酶突变体mut-AcCR(E144A/G152L),其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供了编码上述羰基还原酶突变体mut-AcCR(E144A/G152L)的基因,其基因序列如SEQIDNO.2所示。进一步的,上述一种羰基还原酶突变体mut-AcCR(E144A/G152L)是将羰基化还原酶AcCR通过酶分子突变的手段获得羰基还原酶突变体mut-AcCR(E144A/G152L)。进一步的,将AcCR的基因序列通过标准方法翻译出其氨基酸序列,以该序列在PDB数据库中搜索,选取同源性分别为53%、51%、51%和51%的4RF2、1ZJY、1NXQ和1ZK3三级结构为模板,进行同源建模,并进行能量最小化,获得了羰基还原酶AcCR的三级结构模型。再采用拉氏图(RamachandranPlot)和Profile-3D对同源建模结果中的每个氨基酸残基结构合理性以及所建蛋白模型与蛋白氨基酸序列的匹配度进行评估。确定所建模型合理,可用于后续实验分析。进一步的,将羰基还原酶AcCR三级结构与辅酶NADH进行对接,通过HotSpot2.0预测羰基还原酶的突变热点,选取144E和152G位点作为突变位点。进一步的,通过分子对接分析突变前后羰基还原酶与4’-氯苯乙酮之间的变化,分别将羰基还原酶AcCR、突变体mut-AcCR(E144A/G152L)与4’-氯苯乙酮进行分子对接,分析酶活性位点Ser142、Tyr155和辅酶NADH烟酰胺环C4位于底物4’-氯苯乙酮之间距离及作用力的变化。进一步的,测定羰基还原酶突变体mut-AcCR(E144A/G152L)的活性,测定羰基还原酶突变体mut-AcCR(E144A/G152L)的酶学性质,通过酶活测定的方式研究突变体mut-AcCR(E144A/G152L)的最适温度和pH以及稳定性。本专利技术还提供了上述一种羰基还原酶突变体mut-AcCR(E144A/G152L)在催化羰基化合物的不对称还原中的应用。与现有技术相比,本专利技术具有如下优点和有益效果:本专利技术提供的一种羰基还原酶突变体mut-AcCR(E144A/G152L),克服了原有羰基还原酶酶活力低及底物耐受性差的缺点,具有较高的酶活力和底物耐受性。附图说明图1a、图1b为AcCR及mut-E144A/G152L与4’-氯苯乙酮的对接结果图。图2a、图2b为温度对突变体mut-E144A/G152L活性及稳定性的影响对比图;图3a、图3b为缓冲液pH对突变体mut-E144A/G152L活性及稳定性的影响对比图。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术作进一步详细的描述,但本专利技术的实施方式不限于此。需指出的是以下若有未特别详细说明之处,均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。实施例1将AcCR的基因序列通过标准方法翻译出其氨基酸序列,以该序列在PDB数据库中搜索,选取同源性分别为53%、51%、51%和51%的4RF2、1ZJY、1NXQ和1ZK3(数据库中蛋白质序列的名称)三级结构为模板,进行同源建模,并进行能量最小化,获得了羰基还原酶AcCR的三级结构模型。进一步采用拉氏图(RamachandranPlot)和Profile-3D对同源建模结果中的每个氨基酸残基结构合理性以及所建蛋白模型与蛋白氨基酸序列的匹配度进行评估。确定所建模型合理,可用于后续实验分析。将羰基还原酶AcCR三级结构与辅酶NADH进行对接,通过HotSpot2.0预测羰基还原酶的突变热点,选取144E和152G位点作为突变位点。实施例2通过分子对接分析突变前后羰基还原酶与4’-氯苯乙酮之间的变化;分别将羰基还原酶AcCR、突变体mut-AcCR(E144A/G152L)与4’-氯苯乙酮进行对接,分析酶活性位点Ser142、T本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种羰基还原酶突变体mut‑AcCR(E144A/G152L),其特征在于:其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种羰基还原酶突变体mut-AcCR(E144A/G152L),其特征在于:其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.编码权利要求1所述的羰基还原酶突变体mut-AcCR(E144A/G152L)的基因,其特征在于:基因序列如SEQIDNO.2所示。3.根据权利要求1所述一种羰基还...
【专利技术属性】
技术研发人员:娄文勇,魏萍,宗敏华,郭泽望,区晓阳,
申请(专利权)人:华南理工大学,
类型:发明
国别省市:广东,44
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