一种抗酸型高密度生长的大肠杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗酸型高密度生长的大肠杆菌及其应用，所述埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17‑3保藏号为：CCTCC 2018200。采用上述埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17‑3在培养基中，无需额外进行发酵控制，可自然延长大肠杆菌的对数生长期，在过夜培养时间段内，可使细胞密度OD600值达到30以上，约是其他大肠杆菌的3倍以上，为实现大肠杆菌经济高效的高密度发酵生产提供了重要的宿主细胞。

An Acidic-resistant High Density Growing Escherichia coli and Its Application

The invention discloses an acid-resistant high-density growth E. coli and its application. The storage number of Escherichia coli S17_3 is CCTCC 2018200. Escherichia coli S17 3, the above-mentioned Escherichia coli species, can naturally prolong the logarithmic growth period of Escherichia coli without additional fermentation control. During overnight incubation period, the OD600 value of cell density can reach more than 30 times, which is about three times higher than that of other Escherichia coli strains. It provides a heavy burden for realizing the economical and efficient high-density fermentation of Escherichia coli. Host cells are needed.

【技术实现步骤摘要】
一种抗酸型高密度生长的大肠杆菌及其应用
本专利技术属于微生物领域，具体涉及一种抗酸型高密度生长的大肠杆菌及其应用。
技术介绍
随着生物工程技术的发展，越来越多的微生物发酵的方法应用于化学品、酶蛋白以及药剂的生产。其中，大肠杆菌由于其易于培养，生长迅速，操作简便，成本低、遗传背景清晰且无安全性问题等诸多优点，而成为工业上理想的宿主细胞。工业上实现高密度发酵是利用大肠杆菌发酵生产各类有经济价值化合物的重要前提。利用分子生物学技术使外源基因成功表达是实现目的产物大规模生产的第一步。要想真正实现目的产物的大量生产，必须实现重组菌的大规模培养，也就是高密度发酵技术。高密度发酵是指改变培养方式以及培养条件，提升菌群的生长密度，提高目标产物(氨基酸、代谢产物、蛋白等)的比生产率。高密度发酵技术的实现，不仅可以减少培养体积，缩短发酵周期，还能减少设备投资，降低成本。很多酶蛋白、氨基酸、抗生素等已经通过高密度发酵技术实现了大规模生产。实现菌体的高密度培养对发酵条件提出了较高的要求，影响高密度发酵的因素众多，其中涉及到菌体生长所需的营养物质、发酵中副产物的累积、溶氧、pH、温度、诱导方式及补料策略等。工业上，为了发酵得到高密度菌体，必须合理控制好各个影响因素。在工业上广泛使用的工程菌，比如大肠杆菌BW25113，JM109，BL21(DE3)在LB中补加碳源葡糖糖培养条件下，细胞密度OD600在5.0左右，远远不能满足高密度发酵的需要，通过生物反应器进行高密度发酵需要准确的营养、pH调节、通氧量控制等手段才能做到。
技术实现思路
为了克服现有技术中所存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种埃希氏菌属大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3及其应用。旨在解决现有埃希氏菌属大肠杆菌密度低的问题。为了实现上述目的以及其他相关目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供一种埃希氏菌属大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3，其保藏号为：CCTCC2018200。EscherichiacoliS17-3为实验室保藏的模式大肠杆菌菌种EscherichiacoliS17-1的突变菌株，菌株S17-3已于2018年4月16日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC2018200。本专利技术分离的埃希氏菌属大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3，此菌为两端钝圆的短杆菌，大小约0.5um-3um，具有乳白色且表面光滑的圆形菌落，菌落边缘整齐。经形态学鉴定和16SrDNA序列比对后的发育树分析，确定该菌株为大肠杆菌，按照国际命名规则：属名+种名+株名对该菌株进行命名，属名、种名、株名分别为埃希氏菌属、大肠杆菌种和S17-3，命名为埃希氏菌属大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3，保藏号为：CCTCC2018200。该菌株具有如下优势：在培养基中补加碳源的条件下，外源表达质粒pBhya-CAB的条件下，菌的密度远远高于其他已有的大肠杆菌，细菌的密度(OD600，600纳米光波时的吸光值)可达到32.0以上，是普通大肠杆菌的最高生长密度的3倍以上。此外，该菌在发酵过程中，各种有机酸等副产物的积累远远低于其他已有的大肠杆菌，使得碳源更多的流向主产物。进一步地，所述埃希氏菌属大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3的16SrDNA核苷酸序列如SEQIDNO.14所示。本专利技术所述的埃希氏菌属大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3分泌可拉酸。本专利技术的第二方面，提供前述埃希氏菌属大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3在发酵领域中的用途。本专利技术进一步提供前述埃希氏菌属大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3在重组多肽生产中的用途。本专利技术进一步提供前述埃希氏菌属大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3在化学品转化中的用途。本专利技术进一步提供前述埃希氏菌属大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3在细胞催化中的用途。本专利技术的第三方面提供了一种重组质粒pBhya-CAB，所述重组质粒的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示。本专利技术的第四方面提供了上述质粒的构建方法，所述方法为：(1)构建pBlu片段，所述pBlu片段核苷酸序列如SEQIDNO.7所示，(2)构建PCAB片段，所述PCAB片段的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示(3)通过overlapPCR连接pBlu片段和PCAB片段；(4)筛选出核苷酸序列如SEQIDNO.11所示的质粒。进一步地，所述步骤(1)中pBlu片段是采用1P-F，1P-R作为引物，扩增质粒pBCAB获得。所述1P-F核苷酸序列如SEQIDNO.5所述，1P-R核苷酸序列如SEQIDNO.6。所述质粒pBCAB的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。进一步地，所述步骤(2)中PCAB片段是采用2P-F，2P-R作为引物，扩增质粒pETACAB获得。所述2P-F核苷酸序列如SEQIDNO.8所述，2P-R核苷酸序列如SEQIDNO.9。所述质粒pETACAB核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。进一步地，所述质粒pETACAB是通过采用核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的片段和核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的片段连接后筛选获得。本专利技术的第五方面提供了一种重组埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichiacoli，所述重组埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichiacoli的基因组中转染有质粒pBhya-CAB。所述质粒pBhya-CAB可以通过现有技术的方法转染大肠杆菌种Escherichiacoli。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术公开通过实验室筛选获得的一株大肠杆菌，在LB中补加碳源葡糖糖培养条件下，无需额外进行发酵控制，可自然延长大肠杆菌的对数生长期，在过夜培养时间段内，可使细胞密度OD600值达到30以上，约是其他大肠杆菌的3倍以上，为实现大肠杆菌经济高效的高密度发酵生产提供了重要的宿主细胞。本专利技术菌株保藏信息如下：菌株名称：EscherichiacoliS17-3保藏号为：CCTCC2018200；保藏日期：2018年4月16日；保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；保藏单位简称：CCTCC；保藏单位地址：武汉市武昌珞珈山街道武汉大学生命科学学院。附图说明图1A为质粒pETACAB的结构示意图图1B为质粒pBhya-CAB的结构示意图图2为四株重组大肠杆菌发酵24h得到细胞密度OD600图3大肠杆菌S17-3/pBhya-CAB细胞生长密度OD600随时间变化示意图图4为可拉酸发酵表达的曲线图具体实施方式在进一步描述本专利技术具体实施方式之前，应理解，本专利技术的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本专利技术实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本专利技术的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本专利技术另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本专利技术中使用的所有技术和科学术语与本
技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17‑3，其特征在于，所述埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17‑3保藏号为：CCTCC 2018200。

【技术特征摘要】
1.一种埃希氏菌属大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3，其特征在于，所述埃希氏菌属大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3保藏号为：CCTCC2018200。2.如权利要求1所述的埃希氏菌属大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3，其特征在于，所述埃希氏菌属大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3的16SrDNA核苷酸序列如SEQIDNO.14所示。3.如权利要求1所述的埃希氏菌属大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3，其特征在于，所述埃希氏菌属大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3为两端钝圆的短杆菌，大小0.5–3.0um，具有乳白色且表面光滑的圆形菌落，菌落边缘整齐。4.如权利要求1所述的埃希氏菌属大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3，其特征在于，所述埃希氏菌属大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3分泌可拉酸。5.如权利要求1-4任意一项所述的埃希氏菌属大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3在发酵领域中的用途。6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述用途是指埃希氏菌属大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3在重组多肽生产中的用途。7.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述用途是指埃希氏菌属大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3在化学品转化中的用途。8.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述用途是指埃希氏菌属大肠杆菌种EscherichiacoliS17-3在细胞催化中的用途。9.一种重组质粒pBhy...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙俊松，吴海英，纪明华，凌喆，陈桥，史吉平，李久盛，
申请(专利权)人：中国科学院上海高等研究院，
类型：发明
国别省市：上海,31