一种夫西地酸高产菌株及其选育方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种夫西地酸高产菌株及其选育方法与应用。该夫西地酸高产菌株的名称为梭链孢酸脂球菌NJWW‑0520(Fusidium coccineum NJWW‑0520)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年3月21日，保藏编号为CGMCC No.15473。本发明专利技术通过长时间持续利用DMSO(二甲基亚砜)对夫西地酸生产菌株进行应激定向驯化，选育出该夫西地酸高产菌株。该驯化菌株发酵产夫西地酸的产量高达4932μg/ml，比出发菌株产量(3205μg/ml)提高了53.88％，在实际生物法高效制备夫西地酸生产中得到充分应用。

A high-yield strain of fusidic acid and its breeding method and Application

The invention discloses a high-yield strain of fusidic acid and its breeding method and application. The Fusidium coccineum NJWW 0520 (Fusidium coccineum NJWW 0520) is a high-yielding strain of fusidic acid. It is deposited in the General Microbial Center of the Chinese Committee for the Preservation of Microbial Species. Its storage date is March 21, 2018, and its storage number is CGMCC No. 15473. The method adopts DMSO (dimethyl sulfoxide) to domesticate fusidic acid producing strain under stress for a long time, and breeds the fusidic acid producing strain. The yield of fusidic acid produced by the domesticated strain reached 4932 ug/ml, which was 53.88% higher than that of the original strain (3205 ug/ml). The domesticated strain was widely used in the production of fusidic acid by biological method.

【技术实现步骤摘要】
一种夫西地酸高产菌株及其选育方法与应用
本专利技术属于发酵工程和微生物菌种选育的
，特别涉及一种夫西地酸高产菌株及其选育方法与应用。
技术介绍
夫西地酸，分子式为C31H48O6，分子量为516.69，化学名称为：反-16α-羧基-3β,11β-二羟基-4β,8β,14α-三甲基-18-去甲基-5β,10α-胆甾-(17Z)-17(20),24-二烯-21-酸半水合物，具有甾体样结构，其分子结构与烟曲孢酸、头孢菌素都有着较高的相似度，少部分基团存在差异，差异基团的存在增强了其抑菌作用。实验证明，夫西地酸水溶性极微、脂溶性较好，而夫西地酸钠易溶于水。夫西地酸是一种重要的窄谱抗生素，对G+菌有很强的抑制活性。药物商品主要有夫西地酸钠软膏、夫西地酸钠针剂和干混悬剂等类型，这些不同的剂型可适用于由各种敏感细菌的感染引发的病症，如注射用夫西地酸钠可用于：四肢关节感染、败血症(由细菌引起的)、心脏内膜炎症、囊性纤维化、骨髓炎、皮肤组织感染、肺炎及身体各处创伤性感染等；夫西地酸钠软膏可适用于治疗由于葡萄球菌、链球菌、极小棒状杆菌及其它对夫西地酸钠敏感细菌引起的感染等。夫西地酸属于甾体化合物，由于其分子中不对称中心的存在，化学合成步骤繁琐、成本高、得率低，化学法难以应用到实际工业化的生产中，目前国内外均主要采用微生物发酵法生产制备。夫西地酸从真菌发酵的次级代谢产物中分离得到，其中以枝顶孢属霉菌发酵产夫西地酸产量最高。脂溶性甾体样夫西地酸在菌株内主要参与细胞膜的形成，其化学结构独特，能提高细胞膜的韧性。当菌体培养液中存在有机溶剂时，为避免细胞自身受到伤害，菌体会产生应激反应，合成更多的夫西地酸，促进细胞膜增强稳定性，形成屏障阻止有机溶剂进入菌体细胞对其造成损伤。对外界环境条件的变化快速产生应答，是微生物能够尽快适应并生存的优势之一。生存环境的变化，促使微生物群体特性发生相应的调整。在有机溶剂存在的逆境中，微生物细胞可选择多种方式相适应，主要包含细胞膜成分特点及相应组成的改变：比如，细胞膜通透性变化，长链不饱和脂肪酸、磷酸乙醇胺和磷酸肌醇、麦角甾醇、夫西地酸、海藻糖等组成成分含量增加，冲击蛋白合成，线粒体活性以及质膜ATP酶活性增强等方面，而且上述因素间又相互影响、相互作用，因此，细胞对有机溶剂的应答机制复杂，反应体系涉及多层次、多方面。而细胞膜自身通透性和固醇类等甾体、脂类的含量变化起着最主要作用。长时间持续地利用高浓度强极性有机溶剂对夫西地酸生产菌株进行应激定向驯化，改变生产菌株细胞膜的生理状况，增强其抵抗有机溶剂毒害作用，进而获得夫西地酸高产菌株，此法是一种行之有效技术手段，有利于菌种选育改良。
技术实现思路
为了克服现在菌种的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供一种夫西地酸高产菌株及其选育方法与应用，该驯化菌株发酵产夫西地酸的产量高达4932μg/ml，比出发菌株产量(3205μg/ml)提高了53.88％，在实际生物法高效制备夫西地酸生产中得到充分应用。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种夫西地酸高产菌株,所述菌株名为球形梭链孢菌NJWW-0520(FusidiumcoccineumNJWW-0520)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018年3月21日，保藏编号为CGMCCNo.15473。所述的夫西地酸高产菌株在PDA培养基上生长，27℃培养6d，菌落直径4-6mm，菌落颜色白色至灰白色，偶有淡粉色，气生菌丝丰富、基内菌丝及孢子较少，中心有孢子形成的小白点样的突起，有轻微渗出液，无可溶性色素，菌落整体状态较干硬。一种夫西地酸高产菌株的选育方法，包括以下步骤：(1)耐强极性有机溶剂夫西地酸生产菌株的初步筛选将经固体培养基培养5-6d后的夫西地酸生产菌株的出发菌株接入一级种子培养基中，27℃培养72±5h后按1％接种量转接入二级扩大培养基中，27℃培养25±5h，再按10％的接种量转接入发酵培养基中，27℃培养3d后加入DMSO，DMSO的终浓度为体积百分比12％，强制应激处置6h，于恒温摇床上振荡培养后涂布在PDA固体平板上；待长处菌落后，挑选长势良好、菌落较大的再次接入一级种子培养基，进行再一轮筛选；其中，DMSO的起始浓度为体积百分比12％，每轮筛选DMSO浓度比上一轮浓度提高体积百分比1％，直至培养基平板上只能长出几个单菌落；(2)耐受高浓度强极性有机溶剂菌株富集驯化和平板分离复筛选将初筛获得的耐受菌株接入种子培养基中，27℃培养72±5h后按1％接种量转接入二级扩大培养基中，27℃培养25±5h，再按10％的接种量转接入发酵培养基中，27℃培养3d后加入DMSO，所述DMSO浓度为步骤(1)所用的DMSO的最高浓度，于摇床上恒温振荡培养后涂布在PDA固体平板上，挑选长势最好的菌落进行下一代驯化；经过五代的按步骤(1)所使用的最高浓度的DMSO富集驯化培养，得到夫西地酸高产菌株。优选的，所述一级种子培养基的组成为：种子培养基含葡萄糖2.5％，鱼粉蛋白胨1.0％，酵母粉0.2％，KH2PO40.1％，MgSO40.05％，玉米浆4.0％，轻质碳酸钙0.2％，pH5.9±0.1。优选的，所述二级扩大培养基的组成为：葡萄糖2.5％，鱼粉蛋白胨1.0％，酵母粉0.2％，KH2PO40.1％，MgSO40.05％，玉米浆4.0％，轻质碳酸钙0.2％，pH5.9±0.1。优选的，所述发酵培养基的组成为：蔗糖10.0％，麸质粉0.5％，酵母粉2.0％，玉米浆1.0％，黄豆饼粉0.5％，KH2PO40.1％，MgSO40.05％，轻质碳酸钙0.3％，pH5.9±0.1。优选的，所述的PAD培养基为葡萄糖琼脂培养基；所述葡萄糖琼脂培养基组成为：马铃薯20.0％(去皮切块煮沸至泥状，六层纱布过滤去渣)，葡萄糖2.0％，琼脂2.0％，自然pH。所述出发菌种为球形梭链孢菌(Fusidiumcoccineum)。所述的夫西地酸高产菌株用于生产夫西地酸。包括以下步骤：将所述的夫西地酸高产菌株接入一级种子培养基中，27℃培养72±5h后按1％接种量转接入二级扩大培养基中，27℃培养25±5h，再按10％的接种量转接入发酵培养基，27℃培养7-8d后，获得目标产物夫西地酸发酵液，分离纯化，得到夫西地酸。本专利技术与现有技术相比，其有益效果为：(1)本专利技术提供的夫西地酸高产菌株，其发酵产量高达4932μg/ml，比出发菌株提高了53.88％。(2)本专利技术提供的选育改良菌种方法培育条件温和、操作简单、产出投入比高、容易实施。附图说明：图1是球形梭链孢菌NJWW-0520(FusidiumcoccineumNJWW-0520)的菌落形态图与菌丝、孢子镜检图；其中，图(a)为菌落图片；图(b)为菌丝体显微镜观察图；图(c)为孢子显微镜观察图；图2是HPLC法测定夫西地酸效价的标准曲线；图3是DMSO耐受性球形梭链孢菌菌株驯化过程中夫西地酸产量情况及生物量的示意图；图4是高耐受性球形梭链孢菌菌株在不同驯化过程中夫西地酸产量情况及对应生物量的示意图。具体实施方式下面通过具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种夫西地酸高产菌株,其特征在于，所述菌株名为球形梭链孢菌NJWW‑0520(Fusidium coccineum NJWW‑0520)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年3月21日，保藏编号为CGMCC No.15473。

【技术特征摘要】
1.一种夫西地酸高产菌株,其特征在于，所述菌株名为球形梭链孢菌NJWW-0520(FusidiumcoccineumNJWW-0520)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年3月21日，保藏编号为CGMCCNo.15473。2.权利要求1所述的一种夫西地酸高产菌株的选育方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)耐强极性有机溶剂夫西地酸生产菌株的初步筛选将经固体培养基培养5-6d后的夫西地酸生产菌株的出发菌株接入一级种子培养基中，27℃培养72±5h后按1％接种量转接入二级扩大培养基中，27℃培养25±5h，再按10％的接种量转接入发酵培养基中，27℃培养3d后加入DMSO，DMSO的终浓度为体积百分比12％，强制应激处置6h，于恒温摇床上振荡培养后涂布在PDA固体平板上；待长处菌落后，挑选长势良好、菌落较大的再次接入一级种子培养基，进行再一轮筛选；其中，DMSO的起始浓度为体积百分比12％，每轮筛选DMSO浓度比上一轮浓度提高体积百分比1％，直至培养基平板上只能长出几个单菌落；(2)耐受高浓度强极性有机溶剂菌株富集驯化和平板分离复筛选将初筛获得的耐受菌株接入种子培养基中，27℃培养72±5h后按1％接种量转接入二级扩大培养基中，27℃培养25±5h，再按10％的接种量转接入发酵培养基中，27℃培养3d后加入DMSO，所述DMSO浓度为步骤(1)所用的DMSO的最高浓度，于摇床上恒温振荡培养后涂布在PDA固体平板上，挑选长势最好的菌落进行下一代驯化；经过五代的按步骤(1)所使用的最高浓度的DMSO富集驯化培养，得到...

【专利技术属性】
技术研发人员：高健，黄巍巍，徐虹，李军，张丽，薛锋，倪浩，熊璐璐，
申请(专利权)人：盐城工学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32