一种驴源犬瘟热病毒免疫球蛋白G的制备方法技术

技术编号:20579115 阅读:30 留言:0更新日期:2019-03-16 03:49
本发明专利技术涉及病毒抗体制备技术领域,尤其涉及一种驴源犬瘟热病毒免疫球蛋白G的制备方法。该制备方法包括如下操作:对青年健康驴用犬瘟热灭活疫苗接种免疫,每次免疫后检测抗体滴度和中和抗体效价,当抗体滴度达到1:10000以上、中和抗体效价达到1:256以上时,静脉采血,分离血清,提取、纯化免疫球蛋白G。该方法制备所得的免疫球蛋白G可用于临床治疗犬瘟热病毒病,有效率可达100%,治愈率可达85%以上,解决了犬瘟热病毒抗血清或抗体来源不足的问题。

Preparation of an immunoglobulin G of canine distemper virus from donkeys

The invention relates to the technical field of virus antibody preparation, in particular to a method for preparing canine distemper virus immunoglobulin G from donkeys. The preparation method includes the following operations: immunizing young healthy donkeys with canine distemper inactivated vaccine, detecting antibody titer and neutralizing antibody titer after each immunization. When the antibody titer reaches 1:10000 and neutralizing antibody titer reaches 1:256, venous blood is collected, serum is separated, immunoglobulin G is extracted and purified. The immunoglobulin G prepared by this method can be used in clinical treatment of canine distemper virus disease, with an effective rate of 100% and a cure rate of more than 85%. The problem of insufficient antiserum or antibody sources of canine distemper virus is solved.

【技术实现步骤摘要】
一种驴源犬瘟热病毒免疫球蛋白G的制备方法
本专利技术涉及病毒抗体制备
,尤其涉及一种驴源犬瘟热病毒免疫球蛋白G的制备方法。
技术介绍
犬瘟热(caninedistemper)是由犬瘟热病毒(caninedistempervirus,CDV)引起的犬科、鼬科和浣熊科等动物的一种急性、高度接触性传染病。临床上以双相体温升高、随后支气管炎、卡他性肺炎、严重胃肠炎和神经症状为特征。犬瘟热病毒的宿主动物较广,在自然条件下不仅感染不同年龄、性别及品种的犬,同时还感染鼬科、浣熊科及大熊猫科等多种动物(如大熊猫,虎,狮,小熊猫,猞猁,熊,狼等);同时,犬瘟热的发病率和死亡率较高,未经免疫的10月龄以下的幼犬发病率达80%以上,特别是2-5月龄的幼犬发病率和死亡率最高,死亡率高达90%以上。犬瘟热流行不仅对宠物饲养业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业造成巨大的经济损伤,同时也给宠物主人造成一定的精神压力。所以有效防治犬瘟热不仅具有重要的经济价值,也具有重要的社会效益。目前,犬瘟热的防治主要通过注射疫苗对其进行预防,然而由于疫苗质量、个体对疫苗免疫应答能力及母源抗体干扰等原因,使得免疫后的幼犬不能得到100%的保护,所以在宠物临床上,犬瘟热病已成为宠物临床上常见的传染病。目前治疗犬瘟热的主要方法有:抗血清(抗体)疗法、中药辅助疗法及防止继发细菌感染的抗生素辅助疗法等。中药治疗主要是针对临床症状进行的一种辅助治疗;抗生素治疗则是一种预防细菌继发感染的辅助治疗。抗血清或抗体治疗是针对犬瘟热病毒进行的一种特异性治疗,在犬瘟热的治疗上占有主要地位。目前治疗用的抗血清或抗体主要来源于犬同种动物犬,但由于犬源不足,同时绝大多数犬分散在养犬用户中,有限的养犬厂制备的抗血清和抗体不能满足临床需要,同时制备成本较高,严重影响犬瘟热抗血清和抗体在临床上的应用。
技术实现思路
针对现有技术中治疗犬瘟热的抗血清或抗体主要来源于犬,但犬源不足的问题,本专利技术提供一种一种驴源犬瘟热病毒免疫球蛋白G的制备方法。为达到上述专利技术目的,本专利技术实施例采用了如下技术方案:一种驴源犬瘟热病毒免疫球蛋白G的制备方法,具体包括如下步骤:步骤a、对青年健康驴用犬瘟热灭活疫苗接种免疫,当血液中抗体滴度达到1:10000以上、中和抗体效价达到1:256以上时,静脉采血,分离血清;步骤b、将所述血清与等体积的PBS混合,用饱和硫酸铵溶液盐析,用凝胶层析柱脱盐,用DEAE纤维素柱层析纯化,再次用饱和硫酸铵溶液盐析,用凝胶层析柱脱盐,过滤除菌,即得;其中,所述PBS与所述饱和硫酸铵溶液中均含有0.05~0.1M尿素。本专利技术所提供的驴源犬瘟热病毒抗体的制备方法以驴为免疫动物,产量大、饲养成本低,血清产量大,且对犬瘟热具有良好的抗病能力。通过多次用犬瘟热灭活疫苗接种,能够刺激驴发生免疫应答,在驴血清中产生大量针对犬瘟热病毒的特异性抗体,当抗体滴度、中和抗体效价达到预期值时,血清中的免疫球蛋白G即可用于临床治疗犬瘟热病毒病。从血清中提取、纯化免疫球蛋白G时,在PBS和饱和硫酸铵溶液中添加0.05~0.1mol/L尿素,有利于提高纯化后免疫球蛋白G的稳定性和维持抗体的滴度及中和抗体效价。但尿素用量不能过高,高浓度的尿素会使免疫球蛋白G变性而损失,减少免疫球蛋白G的产量;尿素浓度过低则无法发挥尿素在硫酸铵盐析中对抗体活性的保护作用,使粗体物中免疫球蛋白G的抗体滴度降低。用本专利技术所提供的制备方法制得的免疫球蛋白G来治疗犬瘟热,有效率可达100%,治愈率可达85%以上,从而解决犬瘟热病毒抗血清或抗体来源不足的问题。优选地,步骤a中所述犬瘟热灭活疫苗的毒株为CDV-L强毒株,由该毒株激发产生的抗体可用于对抗犬瘟热强毒株。优选地,所述犬瘟热灭活疫苗为40%(v/v)甲醛灭活苗,不会使被接种的驴染病,但能够促使其产生抗体来抵御犬瘟热强病毒。优选地,步骤a中对青年健康驴接种犬瘟热灭活疫苗的操作为,通过颈部肌肉注射接种三次,相邻两次接种间隔一周,第一次接种用3mL、5×105TCID50/mL灭活苗,后两次接种用6mL、5×105TCID50/mL灭活苗。优选地,步骤a中所述青年健康驴年龄为3.5~4.5岁,体重为250~350kg。优选地,步骤a中所述青年健康驴为马传贫病毒和鼻疽菌阴性,以免其他病原干扰血清中抗体的产生。优选地,步骤b中用孔径为0.2μm的滤膜过滤除菌。以及,本专利技术实施例还提供了一种犬瘟热病毒免疫球蛋白G溶液,所述溶液中的所述免疫球蛋白G按上述制备方法制备所得。该溶液中的免疫球蛋白G能与相应的犬瘟热病毒发生特异性结合而清除病犬体内的病毒,对犬瘟热的治愈率可达到85.7%优选地,所述溶液的溶剂为含有0.05~0.1M尿素的生理盐水或含有0.05~0.1M尿素的PBS,所述免疫球蛋白G的浓度为50~60mg/mL。溶液中的尿素能够维持抗体的滴度及中和抗体效价。免疫球蛋白G在该浓度范围内能达到更好的免疫效果,浓度太低则治疗效果下降,而浓度过高也不能使治疗效果更强,却造成免疫球蛋白G的浪费。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合具体实施例,对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本专利技术,并不用于限定本专利技术。实施例1本实施例提供了一种驴源犬瘟热病毒免疫球蛋白G的制备方法,具体包括以下步骤:1、驴的免疫:选择3.5~4.5岁、体重为250~350kg的当地青年健康驴(马传贫/鼻疽菌为阴性),分3次通过颈部肌肉注射免疫接种犬瘟热灭活苗(CDV-L强毒株的40%v/v甲醛灭活苗,5×105TCID50/mL),第一次接种用3mL,后两次接种用6mL。免疫后在第7、14、21、35d检测抗体滴度和中和抗体效价,当免疫35d时,抗体滴度达到1:16384、中和抗体效价达到1:256以上。2、静脉采血,将血液放入室温或37℃恒温箱中,待血清析出后,离心,收集血清。3、提取、分离免疫球蛋白G:3.1盐析(1)取一定体积的驴血清,加入等量体积的PBS(含有0.01M磷酸盐和0.1M尿素,pH7.0),混匀后边搅拌边滴加含有0.1M尿素的饱和硫酸铵溶液,使硫酸铵溶液的最终饱和度达到25%。在4℃放置30min,使其充分盐析。在4℃下离心15min(3000r/min),弃去沉淀(纤维蛋白原),收集上清液(清蛋白和球蛋白)。(2)量取上清液体积,继续在上清液中滴加含有0.1M尿素的饱和硫酸铵溶液,使硫酸铵溶液的最终饱和度达到50%,混匀,于4℃放置30min。在4℃下离心15min(3000r/min),弃上清(清蛋白),收集沉淀(球蛋白)。(3)用原血清1.5倍体积的PBS(含有0.01M磷酸盐和0.1M尿素,pH7.0)稀释沉淀,滴加含有0.1M尿素的饱和硫酸铵至饱和度为35%,于4℃放置30min。在4℃下离心15min(3000r/min),弃上清(α-和β-球蛋白),收集沉淀,即粗提的免疫球蛋白G。将粗提的免疫球蛋白G沉淀溶于原血清1/10倍体积的PBS(含有0.0175M磷酸盐和0.1M尿素,pH6.7)中,备用。3.2脱盐(1)凝胶的溶胀:用20倍体积的蒸馏水溶胀SephedexG-25凝胶过夜,再用2倍体积的PBS(含有0.01本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种驴源犬瘟热病毒免疫球蛋白G的制备方法,其特征在于,具体包括如下步骤:步骤a、对青年健康驴用犬瘟热灭活疫苗接种免疫,当血液中抗体滴度达到1:10000以上、中和抗体效价达到1:256以上时,静脉采血,分离血清;步骤b、将所述血清与等体积的PBS混合,用饱和硫酸铵溶液盐析,用凝胶层析柱脱盐,用DEAE纤维素柱层析纯化,再次用饱和硫酸铵溶液盐析,用凝胶层析柱脱盐,过滤除菌,即得;其中,所述PBS与所述饱和硫酸铵溶液中均含有0.05~0.1M尿素。

【技术特征摘要】
1.一种驴源犬瘟热病毒免疫球蛋白G的制备方法,其特征在于,具体包括如下步骤:步骤a、对青年健康驴用犬瘟热灭活疫苗接种免疫,当血液中抗体滴度达到1:10000以上、中和抗体效价达到1:256以上时,静脉采血,分离血清;步骤b、将所述血清与等体积的PBS混合,用饱和硫酸铵溶液盐析,用凝胶层析柱脱盐,用DEAE纤维素柱层析纯化,再次用饱和硫酸铵溶液盐析,用凝胶层析柱脱盐,过滤除菌,即得;其中,所述PBS与所述饱和硫酸铵溶液中均含有0.05~0.1M尿素。2.根据权利要求1所述的驴源犬瘟热病毒免疫球蛋白G的制备方法,其特征在于,步骤a中所述犬瘟热灭活疫苗的毒株为CDV-L强毒株。3.根据权利要求2所述的驴源犬瘟热病毒免疫球蛋白G的制备方法,其特征在于,所述犬瘟热灭活疫苗为40%(v/v)甲醛灭活苗。4.根据权利要求3所述的驴源犬瘟热病毒免疫球蛋白G的制备方法,其特征在于,步骤a中对青年健康驴接种犬瘟热灭活疫苗的操作为,通过颈部肌肉注射接种...

【专利技术属性】
技术研发人员:仲飞崔丹霍珊珊张建楼左玉柱吴峰洋郑志强李妍马玉忠
申请(专利权)人:河北农业大学
类型:发明
国别省市:河北,13

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