基于微流控和化学发光免疫分析的超顺磁纳米微粒外泌体分离检测系统及其应用技术方案

本发明专利技术提供了基于微流控技术和化学发光免疫分析的超顺磁纳米微粒外泌体分离检测系统及其应用，属于外泌体分离检测技术领域。超顺磁纳米微粒外泌体分离检测系统采用双抗体夹心法结合外泌体表面蛋白，所形成的超顺磁纳米微粒‑外泌体复合物在被磁化的磁性颗粒分离柱所吸附而稳定结合，利用微流控技术最大限度减少超顺磁纳米微粒‑外泌体复合物的动能，使得外泌体的分离捕获效率得到显著提升。本发明专利技术通过将微流控技术、磁分离技术和化学发光免疫分析相结合，实现外泌体的高效分离和快速检测。所述的超顺磁纳米微粒外泌体分离检测系统在外泌体捕获中的应用。

Superparamagnetic nanoparticle exosome separation and detection system based on microfluidic and chemiluminescent immunoassay and its application

The invention provides a superparamagnetic nanoparticle exosome separation and detection system based on microfluidic technology and chemiluminescent immunoassay and its application, belonging to the field of exosome separation and detection technology. The superparamagnetic nanoparticle exosome separation and detection system combines the double antibody sandwich method with the exosome surface protein. The superparamagnetic nanoparticle-exosome complex formed by superparamagnetic nanoparticle-exosome complex is adsorbed and stably combined by the magnetized magnetic particle separation column. Microfluidic technology is used to minimize the kinetic energy of superparamagnetic nanoparticle-exosome complex and make the separation and capture efficiency of exosome. Significant improvements have been made. The invention realizes efficient separation and rapid detection of exosomes by combining microfluidic technology, magnetic separation technology and chemiluminescent immunoassay. The superparamagnetic nanoparticle exosome separation and detection system is applied in exosome capture.

【技术实现步骤摘要】
基于微流控和化学发光免疫分析的超顺磁纳米微粒外泌体分离检测系统及其应用
本专利技术属于外泌体分离检测
，具体涉及基于微流控和化学发光免疫分析的超顺磁纳米微粒外泌体分离检测系统及其应用。
技术介绍
外泌体是细胞释放到胞外的大小为30nm～200nm的双层膜性囊泡，携带大量蛋白质、脂质和RNAs等物质，介导体内细胞间的信息传导，从而影响细胞的生理功能。外泌体膜表面除了共有标记物(如CD9、CD63、CD81等)外，亦表达多种特异性标记物(如GPC1、GPC3、PSMA、TMEM256、EpCAM等)，这些特异性外泌体高度反映了宿主细胞类型和状态。研究显示，分离检测特异性外泌体对疾病诊断、治疗监控与预后判断具有重要意义，尤其在恶性肿瘤诊断方面具有很高诊断特异性和诊断灵敏度。目前对于体液中特异性外泌体的检测主要是先通过超速离心法进行外泌体的分离纯化，然后对外泌体特殊标记物进行定量检测，这种方式耗时长，不方便，不利于临床常规开展。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术为了提供一种快速高效的基于微流控技术和化学发光免疫分析的超顺磁纳米微粒的外泌体分离检测系统及其应用，从而实现生物样品外泌体的准确、快速检测的目的，方便临床应用。本专利技术提供基于微流控技术和化学发光免疫分析的超顺磁纳米微粒的外泌体分离检测系统，包括生物素标记的外泌体表面蛋白抗体、亲和素包被的超顺磁纳米微粒、发光标记抗体、洗脱液、发光激发液、分离柱、磁分离装置、精密微量注射泵、进样器和化学发光检测仪；所述分离柱包括分离柱柱体、连接在所述分离柱柱体一端的进样管道和连接在所述分离柱柱体另一端的出样管道；所述分离柱柱体中填充有磁性颗粒材料；所述发光标记抗体为化学发光标记物标记的外泌体表面蛋白抗体；所述生物素标记的外泌体表面蛋白抗体或发光标记抗体中外泌体表面蛋白抗体对应的外泌体表面蛋白包括CD9、CD63、CD81、GPC1、GPC3、PSMA、TMEM256或EpCAM；其中所述生物素标记的外泌体表面蛋白抗体或发光标记抗体中外泌体表面蛋白抗体不能同时选择对应同一种类蛋白的抗体。优选的，所述分离柱柱体的内径为1.0～5.0mm；所述分离柱柱体的外径为1.5～5.5mm；所述分离柱柱体的垂直高度为1～8cm。优选的，所述出样管道的内径为0.2～0.8mm；所述出样管道的外径为0.4～1.2mm；所述出样管道的长度为8～15cm。优选的，所述进样管道的内径为0.2～0.8mm；所述进样管道的外径为0.4～1.2mm；所述进样管道的长度为8～15cm。优选的，所述进样管道、出样管道或分离柱柱体的材料为聚四氟乙烯。优选的，所述磁性颗粒材料为球形磁性颗粒；所述球形磁性颗粒的粒径为10～1000μm；所述磁性颗粒材料包括镍、铬、铁或铁氧化物磁性材料。优选的，所述外泌体表面蛋白抗体-超顺磁纳米微粒偶联物中超顺磁纳米微粒的粒径为3～50nm。本专利技术提供了所述的超顺磁纳米微粒外泌体分离检测系统在外泌体分离中的应用。优选的，所述外泌体分离的方法，包括以下步骤：(1)将标记生物素的外泌体表面蛋白抗体、亲和素包被的超顺磁纳米微粒和外泌体样品混合反应，得到第一反应液；(2)将所述第一反应液和发光标记抗体混合，封闭，得到第二反应液；(3)将所述分离柱预先放置于磁分离装置上，将进样器吸取所述步骤(2)中的第二反应液后，与进样管道连接；再将进样器固定在精密微量注射泵上，设定微量注射泵的参数后进样；(4)所述进样完成后，用进样器吸取磷酸盐缓冲液，在通过精密微量注射泵控制下对所述分离柱进行冲洗；(5)所述洗涤完成后，将所述分离柱从磁分离装置上移开，静置5～10min，在精密微量注射泵控制下用洗脱液洗脱捕获的超顺磁纳米微粒-外泌体复合物；(6)将所述捕获的超顺磁纳米微粒-外泌体复合物和发光激活液混合，采用化学发光检测仪检测，将检测结果带入相应的标准曲线中，得到分离的外泌体的浓度。优选的，所述微量注射泵的参数如下：通道数量优选为1～20个通道；进样速度为0.5～2ml/h，最大行程为140mm；行程分辨率为0.03125um；线速度调节分辨率为1～5μm/min；行程控制精度为误差≤±0.5％；额定线性推力为>90N。本专利技术提供的基于微流控技术的超顺磁纳米微粒外泌体分离检测系统，包括标记生物素的外泌体表面蛋白抗体、亲和素包被的超顺磁纳米微粒、发光标记抗体、洗脱液、发光激发液、分离柱、磁分离装置、精密微量注射泵、进样器和化学发光检测仪。所述外泌体分离检测系统采用双抗体夹心法，利用生物素标记的外泌体表面蛋白抗体和亲和素包被的超顺磁纳米微粒形成的外泌体表面蛋白抗体-超顺磁纳米微粒偶联物与样品中的外泌体表面的蛋白发生特异性结合，同时发光标记抗体也针对外泌体表面蛋白，特异性结合形成双抗体夹心的超顺磁纳米微粒-外泌体复合物；分离柱是磁性颗粒材料填充的超顺磁纳米微粒的分离柱，利用柱体内磁性颗粒材料在高强度外加磁场的作用下形成梯度势能场，其远大于超顺磁纳米微粒-外泌体复合物在柱内的动能，实现磁分离过程的稳定性以及有效性，从而提高超顺磁纳米微粒的富集率，进而提高超顺磁纳米微粒捕获目标物的回收率。经从分离柱内洗脱后，加入发光激发液再利用化学发光检测仪检测其发光信号，得到分离的外泌体的浓度。本专利技术提供的超顺磁纳米微粒的外泌体分离检测系统，将分离和定量检测相结合，实现快速高效检测样本中外泌体的目的。同时，本专利技术提供的超顺磁纳米微粒外泌体分离检测系统，将微流控技术和磁分离柱技术相结合，在精密微量注射泵的精确流速控制下最大限度减少超顺磁纳米微粒-超顺磁纳米微粒-外泌体复合物的动能，使得外泌体的分离捕获效率得到显著提升。实验证明，将所述分离系统应用于分离外泌体时，分离的外泌体达到94％的回收率，同时具有较高精密度，最低检测限为2.63×105/μl个外泌体。附图说明图1为本专利技术基于微流控技术的超顺磁纳米微粒外泌体分离检测系统的检测原理图；图2为实施例3中基于微流控技术的超顺磁纳米微粒分离系统分离的健康志愿者血清的外泌体的WB结果图；图3为实施例3中基于微流控技术的超顺磁纳米微粒分离系统分离的血清外泌体的电镜结果图，其中红色箭头标注的为外泌体，白色箭头标注的为本专利使用超顺磁纳米微粒；图4为实施例4中基于微流控技术的超顺磁纳米微粒分离系统检测外泌体的校准曲线图；图5为实施例5中基于微流控技术的超顺磁纳米微粒分离系统对不同临床标本外泌体的分离结果图。具体实施方式本专利技术提供了基于微流控技术和化学发光免疫分析的超顺磁纳米微粒的外泌体分离检测系统，包括生物素标记的外泌体表面蛋白抗体、亲和素包被的超顺磁纳米微粒、发光标记抗体、洗脱液、发光激发液、分离柱、磁分离装置、精密微量注射泵、进样器和化学发光检测仪；所述分离柱包括分离柱柱体、连接在所述分离柱柱体一端的进样管道和连接在所述分离柱柱体另一端的出样管道；所述分离柱柱体中填充有磁性颗粒材料；所述发光标记抗体为化学发光标记物标记的外泌体表面蛋白抗体；所述生物素标记的外泌体表面蛋白抗体或发光标记抗体中外泌体表面蛋白抗体对应的外泌体表面蛋白包括CD9、CD63、CD81、GPC1、GPC3、PSMA、TMEM256或EpCAM；其中所述生物素标记的外泌体表面蛋白抗体或发光标记抗体中外泌体表本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于微流控技术和化学发光免疫分析的超顺磁纳米微粒外泌体分离检测系统，其特征在于，包括标记生物素的外泌体表面蛋白抗体、亲和素包被的超顺磁纳米微粒、发光标记抗体、洗脱液、发光激发液、分离柱、磁分离装置、精密微量注射泵、进样器和化学发光检测仪；所述分离柱包括分离柱柱体、连接在所述分离柱柱体一端的进样管道和连接在所述分离柱柱体另一端的出样管道；所述分离柱柱体中填充有磁性颗粒材料；所述发光标记抗体为化学发光标记物标记的外泌体表面蛋白抗体；所述发光标记抗体或标记生物素的外泌体表面蛋白抗体中外泌体表面蛋白抗体对应的外泌体表面蛋白包括CD9、CD63、CD81、GPC1、GPC3、PSMA、TMEM256或EpCAM；其中所述标记生物素的外泌体表面蛋白抗体或发光标记抗体中外泌体表面蛋白抗体不能同时选择对应同一种类蛋白的抗体。

【技术特征摘要】
1.基于微流控技术和化学发光免疫分析的超顺磁纳米微粒外泌体分离检测系统，其特征在于，包括标记生物素的外泌体表面蛋白抗体、亲和素包被的超顺磁纳米微粒、发光标记抗体、洗脱液、发光激发液、分离柱、磁分离装置、精密微量注射泵、进样器和化学发光检测仪；所述分离柱包括分离柱柱体、连接在所述分离柱柱体一端的进样管道和连接在所述分离柱柱体另一端的出样管道；所述分离柱柱体中填充有磁性颗粒材料；所述发光标记抗体为化学发光标记物标记的外泌体表面蛋白抗体；所述发光标记抗体或标记生物素的外泌体表面蛋白抗体中外泌体表面蛋白抗体对应的外泌体表面蛋白包括CD9、CD63、CD81、GPC1、GPC3、PSMA、TMEM256或EpCAM；其中所述标记生物素的外泌体表面蛋白抗体或发光标记抗体中外泌体表面蛋白抗体不能同时选择对应同一种类蛋白的抗体。2.根据权利要求1所述的超顺磁纳米微粒外泌体分离检测系统，其特征在于，所述分离柱柱体的内径为1.0～5.0mm；所述分离柱柱体的外径为1.5～5.5mm；所述分离柱柱体的垂直高度为1～8cm。3.根据权利要求1所述的超顺磁纳米微粒外泌体分离检测系统，其特征在于，所述出样管道的内径为0.2～0.8mm；所述出样管道的外径为0.4～1.2mm；所述出样管道的长度为8～15cm。4.根据权利要求1所述的超顺磁纳米微粒外泌体分离检测系统，其特征在于，所述进样管道的内径为0.2～0.8mm；所述进样管道的外径为0.4～1.2mm；所述进样管道的长度为8～15cm。5.根据权利要求1～4任意一项所述的超顺磁纳米微粒外泌体分离检测系统，其特征在于，所述进样管道、出样管道或分离柱柱体的材料为聚四氟乙烯。6.根据权利要求1所述的超顺磁...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶志华，王艺芸，刘振平，戴伊蓓，刘伟伟，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33