利用SlPIF3基因创建可调控的番茄核雄性不育系及其创建方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种利用SlPIF3基因创建可调控的番茄核雄性不育系的方法及应用。该发明专利技术在分离鉴定一个调控雄蕊发育的番茄光敏色素作用因子SlPIF3基础上，利用基因定点编辑技术或者诱变技术获得栽培番茄SlPIF3基因纯合的突变株系，该突变植株的营养生长与雌蕊发育不受影响，但花粉败育，表现为雄性不育。不育植株外源喷施生长素，可恢复部分花粉育性，并形成可结籽的果实，且收获的种子种植后在没有喷施生长素条件下发育为雄性不育植株。通过以上途径可以繁殖形成可恢复的核雄性不育株系，解决了目前利用测交方法保存核隐性不育系需要拔除一半可育单株的问题。该技术简化了番茄雄性不育系的培育过程，可提高杂交种纯度，方便地用于番茄优良杂交品种的选育。

Establishment and Application of Regulatory Nuclear Male Sterile Lines in Tomato Using SlPIF3 Gene

The invention discloses a method and application of creating a controllable tomato nuclear male sterile line by using SlPIF3 gene. Based on the isolation and identification of a photosensitive pigmentation factor SlPIF3 which regulates stamen development, a homozygous mutant line of cultivated tomato SlPIF3 gene was obtained by site-directed gene editing or mutagenesis. The vegetative growth and pistil development of the mutant plant were not affected, but pollen abortion showed male sterility. Exogenous application of auxin could restore part of pollen fertility and form seed-bearing fruit, and the harvested seeds developed into male sterile plants without auxin application after planting. Through the above ways, restorable genic male sterile lines can be bred and formed, which solves the problem that half of fertile plants need to be pulled out to preserve nuclear Recessive Male Sterile Lines by cross testing. This technology simplifies the cultivation process of tomato male sterile line, improves the purity of hybrid, and is convenient for the breeding of tomato excellent hybrid varieties.

【技术实现步骤摘要】
利用SlPIF3基因创建可调控的番茄核雄性不育系及其创建方法及应用
本专利技术涉及作物分子育种
，尤其涉及一种利用SlPIF3基因创建可调控的番茄核雄性不育系及其创建方法及应用。技术背景目前在生产上可利用的作物不育体系主要有三类，一类是细胞质雄性不育，有时也被称为细胞质与细胞核互作不育系。目前广泛应用于水稻、油菜等作物的杂交育种中，但其存在恢复系选育困难、转育繁琐，育种周期相对较长；细胞质单一，且易受温度影响，育性的不稳定性导致可育和不育的转变等诸多问题。第二类为细胞核雄性不育。配制组合自由，容易出现强优势组合，特别是隐性核不育，许多材料都可以作为其恢复系，并且不受细胞质的影响，可解决三系中雄性不育细胞质单一化的问题。但制种时需要去掉50％可育株。第三类为基因工程雄性不育，一般育性败育彻底，制种纯度高，转育相对容易(Lingetal.,2007)。细胞工程雄性不育最具有代表性的为利用TA29-barnase等基因构建的转基因作物。但目前该方法受到专利以及转基因技术的限制。番茄(Solanumlycopersicum；2n＝2x＝24)属于茄科(Solanaceae)番茄属植物，是世界上普遍栽培的极其重要的蔬菜作物之一，同时也是生殖发育研究的模式植物。目前植物雄性不育是作物杂种优势利用的重要途径,杂种优势利用作为作物育种的主要方向和目标,在生产上取得了很大地成功。杂种优势也广泛应用于番茄中，但目前普遍采用纯合自交系杂交方法，雄性不育系在番茄杂交制种中应用较少。所以发掘番茄雄性不育调控基因并创建新型可利用的雄性不育系一直是番茄品种选育的重要课题。转录因子可以通过与下游基因启动子序列上的顺式作用元件结合，从而调控下游基因表达。碱性螺旋-环-螺旋转录因子(basichelix-loop-helix,bHLH)基因家族是植物中最大的转录因子家族之一，目前在拟南芥中已经鉴定出147个bHLH基因(Toledoortizetal.,2003)。PIF基因家族作为bHLH基因家族的亚家族，能够与光敏色素互作被称为光敏色素作用因子(phytochromeinteractingfactors,PIFs)(Leivaretal.,2011；Nietal.,1998)。植物雄蕊发育是一个受到严格转录调控的复杂过程，多种转录因子参与调解，包括bHLH、WAKY、MYB等(Koetal.,2014；Zhangetal.,2006)。番茄中一个编码bHLH转录因子的基因突变后得到雄性不育突变体ms1035(Jeongetal.,2014)，水稻基因bHLH142敲除后植株表现为花粉败育，虽然已有不少研究指出bHLH家族基因可能参与调控花粉发育过程，同时拟南芥中已有研究表明PIF3参与光周期响应、光形态建成、非生物抗性、激素信号转导调控方面，而花粉发育过程也涉及激素信号转导等调控途径,但截止目前关于PIF家族基因参与植物中花粉发育相关的研究还未见报道。
技术实现思路
专利技术的目的为克服现有番茄雄性不育利用技术的缺陷，在克隆鉴定一种调控番茄雄蕊发育的新基因基础上，提供一种利用该基因培育新型可调控细胞核雄性不育系的方法。本专利技术鉴定了一个新的番茄核雄性不育调控基因SlPIF3，其敲除突变体可形成稳定的核不育系，可通过外源喷施生长素来部分恢复该突变体花粉育性，从而通过自交实现保持系的功能，该技术解决了利用测交方法保存核隐性不育系需要拔除一半可育单株的问题。该专利技术可用于指导番茄雄性不育系的选育和改良，为番茄优良杂种的选育以及杂种优势的利用提供了技术依据。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：SlPIF3基因在创建番茄核雄性不育系中的应用，所述SlPIF3基因的野生型核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。进一步地，敲除番茄基因组中的SlPIF3基因或沉默SlPIF3的表达活性，使得发育过程中花粉败育，经纯化后获得核不育株系。进一步地，通过以下任意一种方式敲除SlPIF3基因或沉默SlPIF3的表达活性，(1)利用物理或甲基磺酸乙酯(EMS)等化学试剂诱变，使得编码所述SlPIF3的核苷酸部分或完全缺失；(2)利用CRISPR/Cas9基因编辑等技术部分修饰SlPIF3的核苷酸序列；(3)利用上述方法修饰SlPIF3表达启动子或调控序列以抑制编码所述SlPIF3基因的表达；(4)上述(1)-(3)中的任意组合。进一步地，所述纯化方法如下：以花粉败育的不育株系为母本，以番茄优良自交系材料为父本杂交，获得F1代植株可育，以优良自交系材料为轮回亲本，进行回交，PCR检测后代出现两种基因型，AA：Aa＝1:1,留下杂合的可育株继续回交，重复回交等杂合的可育株综合性状同轮回亲本相似，再将其自交，自交后代育性3:1分离，获得纯合不育株系。按照上述方法获得的番茄核雄性不育系。一种番茄核雄性不育系的育性恢复方法，该方法为：对所述番茄核雄性不育系的花蕾外源喷施生长素，以恢复部分花粉育性。所述生长素包括但不限于IAA、NAA等。一种构建番茄核雄性不育系的保持方法，该方法为：对所述番茄核雄性不育系的花蕾外源喷施生长素，部分花粉育性恢复，自交保留种子，继续种植获得不育株系。一种番茄核雄性不育系在构建杂交组合中的应用，利用所述番茄核雄性不育系为母本，以另一个优良亲本材料为父本，配制杂种。与现有技术比较，本专利技术具有的实质性特点和显著的进步为：本专利技术通过遗传转化或人工诱变手段，获得番茄基因SlPIF3定向敲除纯合突变体，与野生型相比slpif3突变体花粉败育并且不育性可稳定遗传。若在现蕾后外源喷施生长素可部分恢复该突变体的育性。本专利技术鉴定了一个新的调控番茄雄蕊发育的转录因子，为创建可调控的核不育系提供了新途径。该方法利用分子生物学方法克隆一个番茄光敏色素作用因子SlPIF3,利用CRISPR/Cas9敲除该基因获得纯合的突变体株系，可创建隐性核不育株系。SlPIF3基因突变的番茄植株花粉败育，不能发育形成正常果实，或只能形成少量单性结实的果实；利用野生型花粉授粉突变体柱头，其子房可正常发育成果实，并含有能够正常萌发的种子，表明雌蕊发育正常；进一步正反交实验证实SlPIF3基因敲除并没有影响番茄雌蕊发育。若对纯合突变体slpif3显花期花蕾外源喷施一定浓度的生长素处理，部分花粉可恢复育性，并形成少量的可结籽的果实，而收获的种子可正常萌发并发育形成核雄性不育系。附图说明图1为利用qRT-PCR分析SlPIF3在番茄不同器官及花发育不同时期的时空表达特性。其中，图1(A)为SlPIF3在番茄不同器官中的表达模式，R:根，S：茎，L：叶，FL：花，FR：果实。图1(B)为SlPIF3在番茄花蕾的不同发育时期的表达。Ⅰ到Ⅵ分别代表番茄花粉母细胞时期、四分体时期、单核小孢子早期、单核小孢子中后期、双核小孢子时期、花粉成熟期这6个发育时期的花蕾。方差利用±SDs表示，3次生物学统计。图2为番茄花发育后期不同花组织中的SlPIF3表达变化。(A)萼片；(B)花瓣；(C)雄蕊；(D)雌蕊。III-VI时期分别代表了单核小孢子早期、单核小孢子中后期、双核期以及成熟期。方差利用±SDs表示，3次生物学统计。图3为番茄SlPIF3在烟草中的亚细胞定位分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.SlPIF3基因在创建番茄核雄性不育系中的应用，所述SlPIF3基因的野生型核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.SlPIF3基因在创建番茄核雄性不育系中的应用，所述SlPIF3基因的野生型核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。2.根据权利要1所述的应用，其特征在于，该应用为：敲除番茄基因组中的SlPIF3基因或沉默SlPIF3的表达活性，使得发育过程中花粉败育，经纯化后获得核不育株系。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过以下任意一种方式敲除SlPIF3基因或沉默SlPIF3的表达活性，(1)利用物理或甲基磺酸乙酯(EMS)等化学试剂诱变，使得编码所述SlPIF3的核苷酸部分或完全缺失；(2)利用CRISPR/Cas9基因编辑等技术部分修饰SlPIF3的核苷酸序列；(3)利用上述方法修饰SlPIF3表达启动子或调控序列以抑制编码所述SlPIF3基因的表达；(4)上述(1)-(3)中的任意组合。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述纯化方法如下：以花粉败育的不育株系...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢钢，杨丹丹，叶蕾，潘长田，刘悦，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33