一种从蛋壳中提取DNA的方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种从蛋壳中提取DNA的方法和试剂盒。该方法包括以下步骤：用DNAaway清洁蛋壳表面；获得蛋壳粉末；将所述蛋壳粉末与水和裂解液混匀，冰浴1.5～2.5h后煮沸8～15min，离心，将上清液置于92～97℃金属浴中，敞口保温0.8～1.2h；提取、纯化DNA。该方法能够大大降低提取成本，并具有更高的可重复型，能够保证从长期储存(至少60天)的每一枚鸡蛋蛋壳样品中提取到能够满足多种研究所需DNA。

A Method and Kit for DNA Extraction from Eggshell

The invention relates to a method and a kit for extracting DNA from eggshells. The method includes the following steps: cleaning the eggshell surface with DNA away; obtaining the eggshell powder; mixing the eggshell powder with water and cracking solution, boiling for 8-15 minutes after 1.5-2.5 h in ice bath, centrifuging, and placing the supernatant in a metal bath at 92-97 (?) C for 0.8-1.2 h in open incubation; extracting and purifying DNA. This method can greatly reduce the cost of extraction, and has a higher repeatability. It can ensure that DNA can be extracted from each egg shell sample stored for a long time (at least 60 days) to meet the needs of many research institutes.

【技术实现步骤摘要】
一种从蛋壳中提取DNA的方法及试剂盒
本专利技术涉及分子生物学
，尤其涉及一种从蛋壳中提取DNA的方法及试剂盒。
技术介绍
柴鸡蛋是指在生态放养条件下由特定的地方鸡种生产的一类鸡蛋，这类鸡蛋由于蛋黄比例大、蛋黄颜色深、风味物质、磷脂、必需氨基酸等含量高而广受消费者欢迎，也正因为如此，柴鸡蛋的生产具有更好的利润回报。正因为柴鸡蛋具有更高的利润，而普通商品蛋鸡早期所产鸡蛋的蛋重较小，从外观上很容易与柴鸡蛋混淆，因此有些人用蛋重较小的普通鸡蛋冒充柴鸡蛋高价销售来牟利，极大地侵害了柴鸡养殖者的利益，也扰乱了市场秩序，因此急需建立一个有效的鉴别鸡蛋品种的可行方法。现有技术中的分子标记技术可用于鉴定鸡品种，但需要产蛋鸡的DNA，而市场上的鸡蛋已经离开了产蛋鸡，无法找到产该蛋的母鸡用于分子标记鉴别。鸡蛋是在输卵管中形成的，在此过程中，输卵管上皮细胞脱落会被包被在蛋壳中，可从这些上皮细胞中提取DNA。目前从蛋壳中提取DNA的方法只有两类：即以蛋白酶K消化细胞裂解物为基础的提取法和基于EDTA溶液浸提结合酚、氯仿抽提的提取法。前者使用的蛋白酶K用量是从其它常规组织中提取DNA的用量的5-10倍，并且该方法需要使用浓缩柱浓缩细胞裂解液，使得DNA提取成本过高，而研究显示该方法不够稳定，不能保证所有样品都能提取获得DNA。后者成本得到了改善，但提取过程需要使用酚、氯仿等有毒有害、腐蚀性强的物质，且需要样品量过大(400mg)，很难在不破坏鸡蛋的前提下获得足够的用于分析DNA的蛋壳样品。
技术实现思路
针对现有蛋壳DNA提取方法存在需要有毒试剂、样本需求量大、成本高、重复性差等的技术问题，本专利技术提供了一种从蛋壳中提取DNA的方法。以及，本专利技术还提供了一种从蛋壳中提取DNA的试剂盒。为达到上述专利技术目的，本专利技术实施例采用了如下的技术方案：一种从蛋壳中提取DNA的方法，包括以下步骤：步骤a、用DNAaway清洁蛋壳表面；步骤b、获得蛋壳粉末；步骤c、将所述蛋壳粉末与水、裂解液混匀，冰浴1.5～2.5h后煮沸8～15min，离心，将上清液置于92～97℃金属浴中，敞口保温0.8～1.2h，得到含蛋壳DNA的浓缩液；其中，所述水的质量为所述蛋壳粉末质量的2～3倍，所述裂解液的体积为所述水的体积的1/3～1/2；步骤d、从所述浓缩液中提取、纯化DNA。该方法用DNAaway对蛋壳表面进行清洁，能够清除蛋壳表面的DNA和其他杂质，以保障后续提取得到的DNA不被环境中的微生物以及其他鸡的DNA污染。由于鸡的细胞被蛋壳的碳酸钙包被，92～97℃金属浴的高温加热能够将蛋壳中的大分子DNA打断为小分子片段，从而提高其通过碳酸钙被膜的效率，因此可显著提高DNA提取效率。金属浴与水浴相比，升温快，水分挥发快，保温0.8～1.2h即可使溶液浓缩为原体积的1/4左右，从而减少后续操作中试剂的使用量，节约试剂，还可避免水浴时产生的水蒸气或操作过程中水浴锅中的水对裂解溶液的污染。该浓缩方法与价格高昂的浓缩柱相比，浓缩成本大大降低。与现有技术相比，本专利技术建立的蛋壳DNA提取方法具有更高的可重复性，能够保证从长期储存(至少60天)的每一枚鸡蛋蛋壳样品中提取到能够满足多种研究所需DNA。通过PCR检测发现，利用本专利技术建立的方法所提取的蛋壳DNA至少可用于400bp长DNA片段的扩增。通过微卫星DNA标记分析可知，本方法所提的蛋壳DNA来自于产该蛋的母鸡，排除了储存环境微生物或其它鸡只DNA的污染，并且，从100mg样品中提取的蛋壳DNA至少能用于10个以上微卫星标记分析，基本可以满足大多数DNA分析的需要，为应用分子标记鉴别真假柴鸡蛋提供了新的研究方法。优选地，步骤c中所述裂解液为三乙醇胺月桂基硫酸盐缓冲液，所述三乙醇胺月桂基硫酸盐缓冲液含有0.08～0.12M的Tris·Cl、0.08～0.12M的EDTA以及25～35mg/mL的三乙醇胺月桂基硫酸盐，pH＝7.8～8.2。用价格低廉的三乙醇胺月桂基硫酸盐代替价格高昂的蛋白酶K，能够大幅降低降解成本。通过对三乙醇胺月桂基硫酸盐缓冲液中各成分及其用量进行优选，使该缓冲液能够很好地裂解细胞和细胞核，释放DNA。优选地，所述三乙醇胺月桂基硫酸盐缓冲液含有0.1M的Tris·Cl、0.1M的EDTA以及30mg/mL的三乙醇胺月桂基硫酸盐，pH＝8.0。优选地，步骤d中提取、纯化DNA的方法为硅胶膜吸附法。使用硅胶膜吸附法替代现有技术中的酚、氯仿抽提，避免了实验人员和有毒有害物质接触。同时，结合92～97℃金属浴的高温加热浓缩裂解溶液，又使得DNA提取效率提高了至少4倍以上，由此可使样品需求量降至酚、氯仿抽提法的四分之一，从而使得本专利技术所建立的方法能够满足多种不同研究的需要，如化石、不破坏鸡蛋提取DNA等难以获得大量样本的实验研究。优选地，用所述硅胶膜吸附法提取、纯化DNA的具体操作为：取出步骤c所得浓缩液的上清液，加入相当于所述上清液4.5～5.5倍体积的结合液，混匀并转移至硅胶膜离心柱中，25～30℃静置1～1.5min，10000～12000rpm离心1～1.5分钟，弃去所述离心柱套管中的液体，用漂洗液漂洗两次后，将所述离心柱10000～12000rpm离心3～4min，转移离心柱至敞口离心管中，向所述离心柱的硅胶膜表面加入无菌双蒸水，室温保温5～6分钟，10000～12000rpm离心1～1.5min，收集DNA；所述结合液含有5.5～6.0M异硫氰酸胍和0.08～0.12MpH为7.2±0.05的Tris·HCl，所述漂洗液为78～82％v/v乙醇。无菌双蒸水的用量以刚好浸透硅胶膜为宜。优选地，上述从蛋壳中提取DNA的方法还包括对步骤d所得DNA进行PCR扩增，所述PCR扩增的扩增引物为：引物1：5‘-TTTGACCAGCGTAGATAA-3’，引物2：5‘-ATGTTAGCAGTGTAGTTG-3’，引物3：5‘-TAGGTTCCGAACGCGATGT-3’。上述引物可用于鉴定多种类柴鸡蛋蛋壳颜色基因型。以上述引物进行PCR扩增后，绿壳基因型纯合个体的扩增产物为一条的400bp的DNA带，杂合个体的扩增产物为300bp和400bp两条DNA带，非绿壳蛋个体的扩增产物为一条300bp的DNA带。优选地，所述PCR扩增的反应体系为：优选地，所述反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，40循环，72℃保温7min，取产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳。以及，本专利技术实施例还提供了一种从蛋壳中提取DNA的试剂盒，所述试剂盒中包括裂解液、硅胶膜离心柱、结合液和漂洗液；所述裂解液为三乙醇胺月桂基硫酸盐缓冲液，所述三乙醇胺月桂基硫酸盐缓冲液含有0.1M的Tris·Cl、0.1M的EDTA以及30mg/mL的三乙醇胺月桂基硫酸盐，pH＝8.0；所述结合液含有6M异硫氰酸胍和0.1MpH为7.2的Tris·HCl，所述漂洗液为80％v/v乙醇。该试剂盒可用于蛋壳DNA的提取。其中裂解液用价格低廉的三乙醇胺月桂基硫酸盐代替价格高昂的蛋白酶K，能够大幅降低降解成本。优选地，该试剂盒还包括DNA提取质量鉴定PCR扩增引物，所述DNA提取质量鉴定PCR扩增引物为：引物1：5‘-TT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从蛋壳中提取DNA的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤a、用DNAaway清洁蛋壳表面；步骤b、获得蛋壳粉末；步骤c、将所述蛋壳粉末与水、裂解液混匀，冰浴1.5～2.5h后煮沸8～15min，离心，将上清液置于92～97℃金属浴中，敞口保温0.8～1.2h，得到含蛋壳DNA的浓缩液；其中，所述水的质量为所述蛋壳粉末质量的2～3倍，所述裂解液的体积为所述水的体积的1/3～1/2；步骤d、从所述浓缩液中提取、纯化DNA。

【技术特征摘要】
1.一种从蛋壳中提取DNA的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤a、用DNAaway清洁蛋壳表面；步骤b、获得蛋壳粉末；步骤c、将所述蛋壳粉末与水、裂解液混匀，冰浴1.5～2.5h后煮沸8～15min，离心，将上清液置于92～97℃金属浴中，敞口保温0.8～1.2h，得到含蛋壳DNA的浓缩液；其中，所述水的质量为所述蛋壳粉末质量的2～3倍，所述裂解液的体积为所述水的体积的1/3～1/2；步骤d、从所述浓缩液中提取、纯化DNA。2.根据权利要求1所述的从蛋壳中提取DNA的方法，其特征在于：步骤c中所述裂解液为三乙醇胺月桂基硫酸盐缓冲液，所述三乙醇胺月桂基硫酸盐缓冲液含有0.08～0.12M的Tris·Cl、0.08～0.12M的EDTA以及25～35mg/mL的三乙醇胺月桂基硫酸盐，pH＝7.8～8.2。3.根据权利要求2所述的从蛋壳中提取DNA的方法，其特征在于：所述三乙醇胺月桂基硫酸盐缓冲液含有0.1M的Tris·Cl、0.1M的EDTA以及30mg/mL的三乙醇胺月桂基硫酸盐，pH＝8.0。4.根据权利要求1所述的从蛋壳中提取DNA的方法，其特征在于：步骤d中提取、纯化DNA的方法为硅胶膜吸附法。5.根据权利要求4所述的从蛋壳中提取DNA的方法，其特征在于：用所述硅胶膜吸附法提取、纯化DNA的具体操作为：取出步骤c所得浓缩液的上清液，加入相当于所述上清液4.5～5.5倍体积的结合液，混匀并转移至硅胶膜离心柱中，25～30℃静置1～1.5min，10000～12000rpm离心1～1.5分钟，弃去所述离心柱套管中的液体，用漂洗液漂洗两次后，将所述离心柱10000～12000rpm离心3～4min，转移离心柱至敞口离心管中，向所述离心柱的硅胶膜表面加入无菌双蒸水，室温保温...

【专利技术属性】
技术研发人员：樊宝良，倪慧勇，王学静，刘慧芳，代敏敏，臧素敏，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：河北,13