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番茄SlPIF4基因、蛋白及其在提高植物耐低温性中的应用制造技术

技术编号:20560020 阅读:30 留言:0更新日期:2019-03-14 04:58
本发明专利技术公开了番茄SlPIF4基因、蛋白及其在提高植物耐低温能力中的应用,所述基因SlPIF4的核苷酸序列为SEQ ID NO.1,其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。通过基因手段构建番茄SlPIF4过表达植株或基因敲除植株,调控所述基因SlPIF4的表达水平来研究其对番茄低温抗性的调控机制,结果发现,低温下SlPIF4过表达可以促进植物激素脱落酸(ABA)和茉莉酸(JA)的积累,抑制赤霉素(GA)的积累,进而诱导番茄低温抗性基因的表达,提高番茄的低温抗性。因此,番茄SlPIF4基因通过诱导体内激素ABA与JA形成从而增强其耐低温能力。本发明专利技术为培育耐低温番茄新品种提供了基因资源,具有较好的潜在应用价值,为研究番茄植物应答逆境信号的机制和耐受不利环境的分子机理奠定理论基础。

SlPIF4 Gene and Protein in Tomato and Their Application in Improving Plant Low Temperature Tolerance

The present invention discloses tomato SlPIF4 gene, protein and its application in improving plant cold tolerance. The nucleotide sequence of the gene SlPIF4 is SEQ ID NO.1, and its corresponding amino acid sequence is shown as SEQ ID NO.2. The mechanism of SlPIF4 over-expression and gene knockout in tomato was studied by gene construction. The results showed that over-expression of SlPIF4 at low temperature could promote the accumulation of plant hormones abscisic acid (ABA) and jasmonic acid (JA), inhibit the accumulation of gibberellin (GA), and then induce the expression of low temperature resistance genes in tomato. Improve the low temperature resistance of tomato. Therefore, tomato SlPIF4 gene can enhance its cold tolerance by inducing the formation of hormones ABA and JA in vivo. The invention provides genetic resources for cultivating new low temperature resistant tomato varieties, has good potential application value, and lays a theoretical foundation for studying the mechanism of tomato plant response to stress signals and the molecular mechanism of tolerance to adverse environment.

【技术实现步骤摘要】
番茄SlPIF4基因、蛋白及其在提高植物耐低温性中的应用
本专利技术涉及基因工程、分子生物学及生理学等领域,具体地说,涉及番茄SlPIF4基因的克隆、转基因载体构建及番茄的转化,尤其涉及SlPIF4基因在提高植物耐低温能力中的应用。
技术介绍
番茄原产地为南美洲热带地区,是世界上栽培最广泛的蔬菜作物之一,为喜温植物,其生长发育对环境变化极其敏感,尤其是温度变化。当遭受低温等外界非生物胁迫时,由于植物的不可移动性,其生长发育及作物产量严重受限。近年来,随着全球极端气候现象的频繁发生,低温已成为限制蔬菜生产发展的瓶颈问题之一。因此,研究番茄响应低温逆境的生理生化变化与分子机理,挖掘调控番茄低温响应的关键基因,为提高番茄的耐低温性及获得耐低温番茄提供重要的理论支撑,这对提高番茄的产量有着重要的应用价值。低温弱光是园艺作物生产的主要限制因子,而光与植物的关系不仅局限于光合作用的辐射能供应,而且光还作为一个信号,参与调节植物生长发育的各个过程,所以研究光信号和温度互作的调控网络,对提高蔬菜的产量、品质和经济效益,以及保障蔬菜均衡供应皆具有十分重要的科学和现实意义。光敏色素互作因子(PIFs)是一类bHLH转录因子,是光和其它环境信号联结的重要调控因子,它通过影响激素、糖、昼夜节律等信号的变化调控植物的生长发育及逆境抗性。植物形态建成中,PIFs与光敏色素互作,被磷酸化、泛素化,随后被降解。有关PIFs的研究大多集中在模式植物拟南芥上,主要研究PIFs对植物下胚轴生长的影响,如拟南芥PIF4在高温下直接调控生长素的含量及其合成基因的表达,诱导植物下胚轴、叶柄的伸长,促使叶片偏下生长以及提早开花。另外,PIFs还参与植物对干旱、盐害等的应答过程,如水稻OsPIL1通过调控下游细胞壁相关基因的表达,促进水稻的节间长度,影响水稻在干旱环境中的植株高度;干旱和高盐处理下,过表达PIF3的转基因玉米较野生型其植株生长状况更好。这些均说明PIFs参与植物对逆境胁迫的应答过程,然而番茄PIFs在低温胁迫中的作用及其调控机制均鲜见报道。因此,通过对SlPIF4基因的克隆、转基因技术培育不同表达量SlPIF4的番茄材料,在提高番茄对低温胁迫的抗性以及挖掘逆境胁迫基因资源方面,具有很好的应用前景。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供番茄SlPIF4基因、蛋白及其在提高番茄耐低温能力中的应用。为了实现本专利技术目的,本专利技术所采用的技术方案如下:番茄SlPIF4基因,所述基因为以下1)-4)中的任意一种核苷酸序列:1)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列;2)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且具有不改变原核苷酸序列功能的核苷酸序列;3)在严格条件下与SEQIDNO:1所示序列杂交获得的具有相同功能的核苷酸序列,所述严格条件为在含0.1%SDS的0.1×SSPE或含0.1%SDS的0.1×SSC溶液中,在65℃下杂交,并用该溶液洗膜;4)与1)、2)或3)的核苷酸序列具有90%以上同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。本专利技术还提供由上述的番茄SlPIF4基因编码获得的蛋白质,该蛋白质具有以下之一的氨基酸序列:1)SEQIDNo:2所示的氨基酸序列;2)SEQIDNo:2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。应当理解,本领域技术人员可根据本专利技术公开的氨基酸序列,在不影响其活性的前提下,取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸,得到所述蛋白的突变序列。应理解,考虑到密码子的简并性及不同物种密码子的偏爱性,本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。本专利技术还提供上述的番茄SlPIF4基因在提高植物耐低温能力中的应用。进一步的,通过基因过表达技术使得所述番茄SlPIF4基因的表达水平上升;所述基因过表达技术具体如下:提取番茄总RNA,反转录获得cDNA,以cDNA为模板,F和R为引物,扩增SlPIF4基因,将扩增产物构建到植物过表达载体上;所述引物F和R的核苷酸序列如SEQIDNO:3和4所示;将植物过表达载体导入宿主细胞中,再利用其侵染目的植株,筛选阳性转基因植株,获得耐低温的转基因植株。进一步的,通过基因编辑技术使得所述基因SlPIF4发生突变;所述基因编辑技术具体如下:利用CRISPR-P网站设计SlPIF4基因靶序列,合成的靶序列退火后连接到AtU6-sgRNA-AtUBQ-Cas9载体的BbsI位点,然后将新得到的AtU6-sgRNA-AtUBQ-Cas9片段连接到pCAMBIA1301载体的HindIII/KpnI位点,构建出番茄SlPIF4基因CRISPR表达载体;其中,所述sgRNA的核苷酸序列如SEQINNO:5所示;将植物过表达载体导入宿主细胞中,再利用其侵染目的植株,筛选阳性转基因植株,获得耐低温的转基因植株。本专利技术使用的植物表达载体为具有35S启动子的表达载体,例如载体pFGC1008-HA或pCAMBIA1301。进一步的,过表达载体质粒为pFGC1008::SlPIF4-HA,基因编辑载体质粒pCAMBIA1301::AtU6-sgRNA(SlPIF4)-AtUBQ-Cas9。进一步的,所述宿主细胞为大肠杆菌细胞或农杆菌细胞,优选所述农杆菌为EHA105。通过本专利技术的基因构建转基因番茄,所述转基因番茄能够提高对低温胁迫的抗性。为了便于对转基因番茄植株进行鉴定及筛选,可对所使用的载体进行加工,如加入植物可选择性标记或具有抗性的抗生素标记物等。前面所述过表达载体pFGC1008中加入了3HA标签蛋白。本专利技术的有益效果如下:通过基因手段构建番茄SlPIF4过表达植株或基因敲除植株,调控所述基因SlPIF4的表达水平来研究其对番茄低温抗性的调控机制,结果发现,低温下SlPIF4过表达可以促进植物激素脱落酸(ABA)和茉莉酸(JA)的积累,抑制赤霉素(GA)的积累,进而诱导番茄低温抗性基因的表达,提高番茄的低温抗性。因此,番茄SlPIF4基因通过诱导体内激素ABA与JA形成从而增强其耐低温能力。本专利技术为培育耐低温番茄新品种提供了基因资源,具有较好的潜在应用价值,为研究番茄植物应答逆境信号的机制和耐受不利环境的分子机理奠定理论基础。本专利技术首次构建了番茄SlPIF4基因过表达和基因敲除的转基因植株,并进行功能研究。通过低温处理实验,发现SlPIF4基因在番茄耐低温胁迫中起到正向调控的作用。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚,下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。图1为本专利技术实施例2中SlPIF4基因过表达番茄株系的植物蛋白WesternBlot检测结果;图2为本专利技术实施例3中SlPIF4基因敲除番茄株系的sgRNA序列的测序结果;图3为本专利技术实施例4中在常温与低温条件下,SlPIF4基因及其蛋白含量的结果;其中,A为SlPIF4基因的表达水平,B为SlPIF4蛋白含量的水平;图4为本专利技术实施例4中在常温与低温条件下,转基因番茄pif4#3和pif4#10、OE#87和OE#89表现耐低温的表型;图5为本专利技术实施例4中在常温与低温条件下,转基因番茄pif4#3和pif4#10、OE#87和OE#8本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.番茄SlPIF4基因,其特征在于,所述基因为以下1)‑4)中的任意一种核苷酸序列:1)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列;2)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且具有不改变原核苷酸序列功能的核苷酸序列;3)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交获得的具有相同功能的核苷酸序列,所述严格条件为在含0.1%SDS的0.1×SSPE或含0.1%SDS的0.1×SSC溶液中,在65℃下杂交,并用该溶液洗膜;4)与1)、2)或3)的核苷酸序列具有90%以上同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.番茄SlPIF4基因,其特征在于,所述基因为以下1)-4)中的任意一种核苷酸序列:1)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列;2)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且具有不改变原核苷酸序列功能的核苷酸序列;3)在严格条件下与SEQIDNO:1所示序列杂交获得的具有相同功能的核苷酸序列,所述严格条件为在含0.1%SDS的0.1×SSPE或含0.1%SDS的0.1×SSC溶液中,在65℃下杂交,并用该溶液洗膜;4)与1)、2)或3)的核苷酸序列具有90%以上同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。2.由权利要求1所述的番茄SlPIF4基因编码获得的蛋白质,其特征在于,该蛋白质具有以下之一的氨基酸序列:1)SEQIDNo:2所示的氨基酸序列;2)SEQIDNo:2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。3.权利要求1所述的番茄SlPIF4基因在提高植物耐低温能力中的应用。4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,通过基因过表达技术使得所述番茄SlPIF4基因的表达水平上升。5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述基因过表达技术具体如下:提取番茄总RNA,反转录获得cDNA,以cDNA为模板,F和R为引物,扩增Sl...

【专利技术属性】
技术研发人员:周艳虹王峰陈笑笑喻景权
申请(专利权)人:浙江大学
类型:发明
国别省市:浙江,33

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