本发明专利技术涉及一种羊痘、山羊传染性胸膜肺炎二联灭活疫苗及其制备方法。本发明专利技术采用山羊痘病毒AV41株和山羊支原体山羊肺炎亚种C87001株分别接种悬浮培养的BHK‑21细胞和适宜培养基培养，收获培养物，经浓缩、纯化，分别用BEI和硫柳汞灭活后，按一定比例加入适宜佐剂混合乳化制成。用于预防山羊痘和山羊传染性胸膜肺炎。本发明专利技术系国际上首次获得羊痘和山羊传染性胸膜肺炎的二联灭活疫苗，可实现一针两防的目的，同时，采用本发明专利技术提出的悬浮培养BHK‑21细胞生产羊痘灭活疫苗，较原绵羊睾丸细胞制备的活疫苗具有明显的优势，可解决目前羊痘活疫苗生产过程中面临的绵羊睾丸来源困难、易引起羔羊死亡、母羊流产，以及疫苗需皮内免疫，在临床使用过程中难以操作等问题。
A combined inactivated vaccine of goat pox and goat infectious pleuropneumonia and its production method
The invention relates to a sheep pox and goat infectious pleuropneumonia inactivated vaccine and a preparation method thereof. The method adopts AV41 strain of goat pox virus and C87001 strain of goat mycoplasma pneumonia subspecies to inoculate suspension cultured BHK_21 cells and suitable culture medium respectively. The culture is harvested, concentrated and purified, inactivated by BEI and thiomersal respectively, and then mixed emulsified with appropriate adjuvants in a certain proportion. It is used to prevent goat pox and infectious pleuropneumonia in goats. The invention is the first inactivated vaccine of sheep pox and goat infectious pleuropneumonia in the world, which can achieve the purpose of one needle and two defenses. Meanwhile, the inactivated vaccine of sheep pox is produced by suspension culture of BHK_21 cells, which has obvious advantages over the live vaccine prepared by original sheep testicle cells, and can solve the sheep testicle problems faced in the production of live vaccine of sheep pox. Difficult source, easy to cause lamb death, ewe abortion, intradermal immunization of vaccine, difficult to operate in clinical use and other issues.
【技术实现步骤摘要】
一种羊痘、山羊传染性胸膜肺炎二联灭活疫苗及其生产方法
本专利技术涉及一种羊痘、山羊传染性胸膜肺炎二联灭活疫苗及其生产方法。属于兽用生物制品领域。
技术介绍
养羊业与国民经济的发展和各族人民生活水平的提高关系十分密切，特别是进入21世纪后，我国养羊业得到快速发展，成果显著，养羊业在国民经济中的比重也逐年提高。根据联合国粮农组织(FAO)数据，2013年，中国大陆地区的山羊养殖量即达1.83亿头。2014年，中国大陆地区的山羊养殖量为1.88亿头。虽然我国养羊数量位居世界首位，但与养羊业发达的国家相比，疫病防控水平较薄弱，这在一定程度上制约了我国养羊业的发展。羊痘是世界动物卫生组织(OIE)规定的必须报告的传染病之一，羊痘病毒(Capripoxviruses)属于痘病毒科山羊痘病毒属。羊痘是由绵羊痘和山羊痘引起的一种接触性传染病，呈流行性。它的特征是在全身皮肤、粘膜上出现典型的痘疹，病羊发热并有较高的死亡率，其中羔羊的发病致死率可高达100％，妊娠母羊常发生流产。本病主要通过呼吸道感染，在冬末春初流行，大多数绵羊山羊生产国均有流行。非洲、亚洲大部分国家报道该病的发生。这些疫病一旦发生，病情迅猛，传播性强，死亡率高，损失极大，国际上始终都对这类烈性疫病高度重视，严加防范。我国近3年的羊痘疫情时有发生，给我国养羊业造成重大损失。山羊传染性胸膜肺炎(Contagiouscaprinepleurpneumonia,CCPP)是由山羊支原体山羊肺炎亚种(M.capricolumsubsp.capripneumoniae,Mccp，引起的一种山羊特有的急性或慢性高度接触性传染病，以呈现纤维素性肺炎和胸膜炎为特征,发病率为22％～30％，个别地区高达60％～80％，死亡率15％～30％。该病在非洲、亚洲等数十个国家和地区都有流行，对山羊养殖业带来了较为严重的损失，被世界动物卫生组织列为B类传染病。我国于1947年首发于甘肃,继而在内蒙古、四川、山东、湖北、河北、云南、江西、江苏等地陆续发现。近几年，在湖南、河南、贵州、重庆、内蒙等地区都有CCPP的报道，给山羊养殖业造成了较大的经济损失。目前，我国羊群中羊痘和山羊传染性胸膜肺炎感染的状况仍非常普遍，疫苗免疫是我国防控羊痘和山羊传染性胸膜肺炎的主要手段。其中，目前我国广泛应用的山羊痘活疫苗，经过长期的临床实践检验，发现还存在如下3项主要不足，一是生产种毒存在一定的残余毒力，易引起羔羊死亡、母羊流产，存在较大的安全隐患；二是需采用原代绵羊睾丸细胞制备疫苗，生产过程中面临绵羊睾丸来源困难的问题，且存在原代细胞携带外源病毒的生物安全风险；三是需皮内免疫，在临床使用过程中难以操作。本专利技术提出的羊痘、山羊传染性胸膜肺炎二联灭活疫苗，采用山羊痘病毒AV41株和山羊支原体山羊肺炎亚种C87001株分别接种悬浮培养的BHK-21细胞和适宜培养基培养，收获培养物，经浓缩、纯化，分别用BEI和硫柳汞灭活后，按一定比例加入适宜佐剂混合乳化制成。用于预防山羊痘和山羊传染性胸膜肺炎。本专利技术系国际上首次获得羊痘和山羊传染性胸膜肺炎的二联灭活疫苗，可实现一针两防的目的，同时，采用本专利技术提出的悬浮培养BHK-21细胞生产羊痘灭活疫苗，较原绵羊睾丸细胞制备的活疫苗具有明显的优势，可解决目前羊痘活疫苗生产过程中面临的绵羊睾丸来源困难、易引起羔羊死亡、母羊流产，以及疫苗需皮内免疫，在临床使用过程中难以操作等问题。
技术实现思路
本专利技术目的在于制备出一种羊痘、山羊传染性胸膜肺炎二联灭活疫苗，用于预防山羊痘、绵羊痘和山羊传染性胸膜肺炎。本专利技术技术方案1.一种羊痘、山羊传染性胸膜肺炎二联灭活疫苗，其特征在于所述灭活疫苗含有采用悬浮培养BHK-21细胞生产的山羊痘病毒抗原和山羊支原体山羊肺炎亚种抗原。2.本专利技术所述羊痘、山羊传染性胸膜肺炎二联灭活疫苗，其特征在于所述羊痘抗原生产毒株为山羊痘病毒AV41株。3.本专利技术所述二联灭活疫苗，其特征在于所述山羊支原体山羊肺炎亚种抗原生产菌株为C87001株。4.本专利技术所述羊痘、山羊传染性胸膜肺炎二联灭活疫苗，其特征在于所述生产用BHK-21细胞采用纯悬浮培养工艺，培养过程中无需添加载体。5.本专利技术所述羊痘、山羊传染性胸膜肺炎二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于用所述山羊痘病毒AV41株和山羊支原体山羊肺炎亚种C87001株分别接种悬浮培养的BHK-21细胞和适宜培养基培养，收获培养物，经浓缩、纯化，分别用BEI和硫柳汞灭活后，按一定比例加入适宜佐剂混合乳化制成二联灭活疫苗。用于预防山羊痘和山羊传染性胸膜肺炎。本专利技术具体实施方式1.二联灭活疫苗的制备(1)生产和检验用毒种生产用毒种为山羊痘病毒AV41株，检验用毒种为山羊痘病毒AV40株，均由中国兽医药品监察所制备并提供(请见中国兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著，中国兽医菌种目录(第二版)，中国农业科学技术出版社，2002年，p142)。(2)生产和检验用菌种山羊支原体山羊肺炎亚种C87001株生产用基础种子，山羊支原体山羊肺炎亚种C87002株为疫苗检验用菌种，由中国兽医药品监察所制备并提供(该菌原分类命名为丝状支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasmamycoidessuhsp.capriEdwardandFreundt)(请见中国兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著，中国兽医菌种目录(第二版)，中国农业科学技术出版社，2002年，p89)。(3)生产用细胞制备从液氮罐中取出BHK-21细胞(由中国兽医药品监察所制备并提供(请见中国兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著，中国兽医菌种目录，中国农业科学技术出版社，2008年，p147)，迅速置36～37℃水浴解冻，转入装有MEM培养液的无菌离心管中，以800r/min离心5min，用含2％血清的MEM培养液重悬细胞后转入细胞摇瓶，置37℃恒温振荡培养箱中，以160～200r/min振荡培养，当摇瓶细胞密度达到不低于2×106个/ml时，将摇瓶中细胞按0.5×106个/ml的密度注入到一级反应器，并采用同样方法逐级放大到二级反应器，反应器搅拌速度为60～100r/min，溶氧(DO)40％～60％，pH值7.0～7.4，温度为36～37℃，培养48～72小时。(4)生产用毒种制备当生物反应器细胞密度达2×106个/ml以上、活率90％以上时，按2％～8％的比例接种病毒液，调整反应器搅拌速度为60～100r/min，溶氧(DO)40％～60％，pH值7.0～7.4，36～37℃培养，定时取样观察细胞病变，当细胞活率低于20％时收获培养物，注明毒种名称、批号、代次、收获日期，置-20℃以下保存，作为生产用悬浮细胞毒种。(5)生产用菌种制备取C87001株冻干菌种1支，接种含15％马血清的EZH液体培养基，置37℃培养3～5日，当培养基pH值下降至7.0左右时，作为制苗用一级种子。取一级种子，接种含15％马血清的EZH液体培养基，置37℃培养3～5日，当培养基pH值下降至7.0左右时，作为制苗用二级种子。(6)制苗用病毒液的制备当生物反应器内细胞密度达到2×106个/ml以上时，按2％～8％的比例接种AV41株悬浮细胞毒。接种后，调整反应器本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种羊痘、山羊传染性胸膜肺炎二联灭活疫苗，其特征在于所述灭活疫苗含有采用悬浮培养BHK‑21细胞生产的山羊痘病毒抗原和山羊支原体山羊肺炎亚种抗原。
【技术特征摘要】
1.一种羊痘、山羊传染性胸膜肺炎二联灭活疫苗，其特征在于所述灭活疫苗含有采用悬浮培养BHK-21细胞生产的山羊痘病毒抗原和山羊支原体山羊肺炎亚种抗原。2.如权利要求1所述羊痘、山羊传染性胸膜肺炎二联灭活疫苗，其特征在于所述羊痘抗原生产毒株为山羊痘病毒AV41株。3.如权利要求1所述羊痘、山羊传染性胸膜肺炎二联灭活疫苗，其特征在于所述山羊支原体山羊肺炎亚种抗原生产菌株为C87001株。4.如权利要求1所述羊痘、山羊传染性胸膜肺...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈小云，王磊，杜吉革，张敏，王静文，朱真，薛麒，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：北京,11
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