一种双重响应性纳米颗粒及其在肿瘤抑制中的应用制造技术

技术编号:20553992 阅读:38 留言:0更新日期:2019-03-14 01:50
本发明专利技术属于肿瘤抑制药剂研发技术领域,具体涉及一种双重响应性纳米颗粒及其在肿瘤抑制中的应用专利申请事宜。该纳米颗粒名为P‑T4,属于一种两亲性多肽结构,氨基酸部分序列如SEQ ID NO.1所示,具体结构式表示为PEGx‑K‑DEAP‑AAN‑NLLMAAS。本申请以肿瘤微环境中表达Tie2分子的Tie2

A Dual Responsive Nanoparticle and Its Application in Tumor Suppression

The invention belongs to the technical field of research and development of tumor suppressive agents, in particular to a dual responsive nanoparticle and its application in patent application for cancer suppressive drugs. The nanoparticles, named P_T4, belong to an amphiphilic polypeptide structure. The amino acid sequence is shown in SEQ ID NO.1. The specific structure of the nanoparticles is PEGx_K_DEAP_AAN_NLLMAAS. Tie2 Expressing Tie2 Molecule in Tumor Microenvironment

【技术实现步骤摘要】
一种双重响应性纳米颗粒及其在肿瘤抑制中的应用
本专利技术属于肿瘤抑制药剂研发
,具体涉及一种双重响应性纳米颗粒及其在肿瘤抑制中的应用专利申请事宜。
技术介绍
复发是肿瘤化疗中治疗和预防的难点,也是造成死亡的主要原因之一。常规化疗药在治疗初期可以有效的抑制肿瘤的生长,但是大多数都是以复发而告终,研究表明血管重建在化疗后复发中占有相当重要的位置。已有研究表明:Tie2分子是酪氨酸激酶受体家族中的蛋白质成员之一,在血管内皮细胞上广泛表达。Tie2、Tie1作为酪氨酸激酶受体介导血管生成素配体1/2(Ang2/Ang1)的各种功能。Tie2-Ang2信号通路在肿瘤血管生成中发挥重要作用,并参与内皮细胞的增殖,迁移和稳定。除了内皮细胞上面的广泛表达外,Tie2分子还表达在巨噬细胞上。已有证据表明Tie2高表达的巨噬细胞(Tie2positivemacrophage,TAM)可以促进肿瘤血管生成。同时已有研究发现特异性敲除巨噬细胞上的Tie2受体可以明显的抑制化疗后复发的血管重建,并且影响了巨噬细胞在肿瘤组织中的活力,因此以Tie2分子作为靶向目标设计治疗药剂,对于相关肿瘤化疗后复发的抑制和预防应当是具有较好应用效果的。现有技术中,靶向Tie2受体是有较多技术方案的,尤其是部分短肽表现出一定应用效果,但短肽在生物体内的不稳定性及较短的半衰期使得其难以直接应用。现有技术中,为增加小分子肽的稳定性和生物利用度,可以对这些小分子肽进行一定改造,常规改造方式包括环化或PEG化。但是这种改造应当是以小分子肽功能不受影响作为前提的,因此现有改造方式是否适合短肽T4、以及如何对短肽T4进行改造尚需进一步探讨和验证。
技术实现思路
本申请以表达Tie2分子的Tie2+巨噬细胞和内皮细胞作为靶向细胞,通过对短肽T4纳米化改造提供一种双重响应性纳米颗粒P-T4,通过增加其生物体内的稳定性和生物利用度,抑制肿瘤血管新生和肿瘤的化疗后复发,即发挥抑制肿瘤化疗后复发的作用,从而为相关疾病的治疗和改善奠定一定技术基础。本申请所提供的技术方案详述如下。一种双重响应性纳米颗粒,将其命名为P-T4,该纳米颗粒主要是通过对疏水性短肽T4(NLLMAAS)的纳米化修饰改造获得,改造后P-T4属于一种两亲性多肽结构,氨基酸部分序列如SEQIDNO.1所示,具体结构式表示为:PEGx-Lys(DEAP)-Ala-Ala-Asn-Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Ser,或者表示为:PEGx-K(DEAP)-AAN-NLLMAAS;所述x=800~2000,需要解释的是,根据分子量计算及生物体内纳米结构形态设计需要,在x=1000(即PEG1000)时,纳米结构更为合适;纳米颗粒改造原理为:由豆荚蛋白酶剪切的底物Ala-Ala-Asn和微酸响应的异硫氰酸3-二乙氨基丙酯(DEAP)修饰的赖氨酸(Lys-DEAP)共轭链接在短肽T4上构成疏水段,由PEG1000修饰改造后作为亲水端,从而具备双亲性和双重响应性,而改造后在不影响短肽活性基础上可明显延长短肽的半衰期。所述双重响应性纳米颗粒P-T4的具体制备方法,包括如下步骤:(一)采用固相多肽合成法制备PEGx-K-AAN-NLLMAAS,具体参考如下步骤:(1)树脂溶涨:称取2-ChlorotritylChlorideResin树脂,放入反应管中,加DCM,振荡混合均匀;(2)接第一个氨基酸:抽滤掉溶剂,加入Fmoc-Ser(tBu)-OH氨基酸、DIEA、DM,振荡反应,充分反应后清洗;(3)脱保护:用含有哌啶的DMF溶液进行脱保护;(4)检测和清洗:对步骤(3)中脱保护后树脂进行茚三酮检测,以确定反应程度,并进行清洗;(5)缩合:在步骤(4)中清洗后树脂中加入氨基酸(Fmoc-Ala-OH)、HBTU、DIEA充分反应;反应结束后清洗;重复步骤(2)~步骤(5),依次连接各氨基酸和mPEGx-COOH,制备获得PEGx-K-AAN-NLLMAAS;(二)利用DEAP修饰步骤(一)中所合成制备的PEGx-K-AAN-NLLMAAS,具体步骤参考如下:(1)在步骤(一)制备所得树脂中加入含有水合肼的DMF,去除赖氨酸保护基dde,然后加入3-(二乙基氨基)丙基异硫氰酸酯(DEAP)、HBTU、DIEA,充分反应;(2)对步骤(1)中反应结束后物料进行清洗(具体例如采用甲醇进行清洗),并从树脂上切割DEAP修饰改造后多肽,洗涤、干燥后即为:PEGx-K(DEAP)-AAN-NLLMAAS;(三)对步骤(二)PEGx-K(DEAP)-AAN-NLLMAAS进行纳米化改造,制备双重响应性纳米颗粒P-T4,具体步骤为:将步骤(二)制备所得PEGx-K(DEAP)-AAN-NLLMAAS溶于DMSO(二甲基亚砜)中,超声(功率具体例如为100w)处理条件下,将其逐滴滴加PBS中,制备形成纳米粒溶液,即为纳米化改造后的P-T4,即可进一步用于抑制肿瘤的化疗后复发;具体纳米化改造时,具体物料用量为:PEGx-K(DEAP)-AAN-NLLMAAS用量为1mg,DMSO用量为10μL,PBS具体为pH=7.4,具体用量为1mL。所述双重响应性纳米颗粒P-T4在制备肿瘤抑制药剂中的应用,主要用于抑制肿瘤化疗治疗后的肿瘤复发,所述肿瘤具体例如为乳腺癌肿瘤;所述化疗,具体例如为阿霉素(DOX)或脂质体阿霉素化疗治疗后肿瘤;具体应用时,其作用原理为(如图1中图a、图b所示):所制备的纳米颗粒P-T4在血液循环中可保持纳米粒结构而不干扰正常血管上的Tie2受体信号,而在EPR效应(enhancedpermeabilityandretentioneffect,实体瘤的高通透性和滞留效应)下可被动聚集在肿瘤部位,在肿瘤部位特异性高表达豆荚蛋白酶和微酸作用下将功能性短肽T4释放出来,在肿瘤局部的微环境中通过靶向肿瘤微环境中Tie2+巨噬细胞,特异性干扰Tie2受体进而抑制肿瘤血管新生和肿瘤的复发。现有研究表明,经过放化疗或抗血管治疗后,肿瘤微环境内存在着大量的Tie2+巨噬细胞,这些细胞与化疗后血管重建正相关。部分研究也表明,这些巨噬细胞也可作用在肿瘤细胞上,并促进肿瘤细胞的转移。作为本申请改造目标T4肽(NLLMAAS)而言,其属于短肽,已有研究表明,该短肽可以特异性结合Tie2受体,抑制信号转导、血管新生,可被瘤内注射用于阻断ANG1/Tie2受体信号,但该短肽疏水性强,生物利用度低,并且无组织特异性,因此限制了其应用,而对该短肽进行不同形式的改造,以增强其生物利用度和应用效果是必须的。本申请中,通过将疏水性短肽T4肽进行改造,使其具有双重响应特性,进一步通过将其纳米化处理,使其自组装成纳米粒来提高其在生物体内的稳定度和生物利用度。初步应用实验即分析表明:纳米化后P-T4可较好聚集于肿瘤微环境中,在肿瘤微酸性环境和高表达的豆荚蛋白酶作用下释放功能性短肽T4,从而局部干扰Tie2受体信号来抑制血管重建进而抑制肿瘤化疗后复发。这种设计及改造不仅实现了短肽T4在肿瘤局部微环境中的特异性释放,而且可有效减少对正常组织的损伤,并且明显提升了短肽T4的半衰期和生物利用度,从而有效的抑制肿瘤化疗后复发。总之,本申请以肿瘤微环本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种双重响应性纳米颗粒,其特征在于,该纳米颗粒名为P‑T4,属于一种两亲性多肽结构,氨基酸部分序列如SEQ ID NO.1所示,具体结构式表示为:PEGx‑Lys‑DEAP‑Ala‑Ala‑Asn‑Asn‑Leu‑Leu‑Met‑Ala‑Ala‑Ser,或者表示为:PEGx‑K‑DEAP‑AAN‑ NLLMAAS;所述x=800~2000。

【技术特征摘要】
1.一种双重响应性纳米颗粒,其特征在于,该纳米颗粒名为P-T4,属于一种两亲性多肽结构,氨基酸部分序列如SEQIDNO.1所示,具体结构式表示为:PEGx-Lys-DEAP-Ala-Ala-Asn-Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Ser,或者表示为:PEGx-K-DEAP-AAN-NLLMAAS;所述x=800~2000。2.如权利要求1所述双重响应性纳米颗粒,其特征在于,x=1000,即PEGx=PEG1000。3.权利要求1或2所述双重响应性纳米颗粒的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:(一)采用固相多肽合成法制备PEGx-K-AAN-NLLMAAS,(二)利用DEAP修饰步骤(一)中所合成制备的PEGx-K-AAN-NLLMAAS;(三)对步骤(二)PEGx-K(DEAP)-AAN-NL...

【专利技术属性】
技术研发人员:秦志海张利静赵颖王菲聂广军
申请(专利权)人:郑州大学第一附属医院
类型:发明
国别省市:河南,41

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