一种基于[Ru(bpy)3]制造技术

本发明专利技术涉及一种基于新型纳米多孔材料Ru(bpy)3

A new method based on [Ru(bpy)3]

The invention relates to a novel nanoporous material Ru(bpy)3.

【技术实现步骤摘要】
一种基于[Ru(bpy)3]2+/Zn-oxalate的免疫传感器的制备方法
本专利技术涉及一种基于Ru(bpy)32+/Zn-oxalateMOFs的双猝灭夹心型电致化学发光免疫传感器的制备方法及应用。具体涉及发光材料Ru(bpy)32+/Zn-oxalateMOFs和纳米多孔材料Au@NiFeMOFs的制备及其在电致化学发光传感器中的应用。Au@NiFeMOFs具有高的孔隙率、大的比表面积和良好的导电性被用来作为双重猝灭剂标记抗体从而达到对化学发光信号双重猝灭的作用。本专利技术属于电化学发光检测

技术介绍
从阿尔茨海默症（AD）患者脑内的细胞质基质中分离出来的β-淀粉样蛋白（Aβ）可溶性寡聚物已经被证明可以损害海马突出可塑性、减少突触、诱导tau蛋白过度磷酸化，还会引起神经性营养不良、激活小胶质细胞炎症、损害记忆等症状（在不存在淀粉样斑块的情况下）。AD作为一种进行性不可逆神经系统疾病，严重威胁着人类的健康，大大降低了许多中老年人的生活质量。经过对AD患者大量的科学研究，Aβ由于其具有非常强的神经毒性被认为是AD发病机制的关键，因此被选作诊断AD的生物标志物和治疗靶点。然而寻找一种可以简便快捷灵敏的Aβ检测方法有着重要意义。电化学发光方法消耗低、容易控制、灵敏度高且检测限低，具有电化学和化学发光两种方法的优势，是一种环境友好型方法。因此本专利技术设计了一种双猝灭夹心型电致化学发光免疫分析方法用于早期AD患者脑内细胞质基质Aβ的检测。在本专利技术中，首次使用一种新型多孔材料Ru(bpy)32+/Zn-oxalateMOFs作为电化学发光材料并引入到电化学发光领域。Zn-oxalateMOFs表面带有许多负电荷又因其多孔性具有较大的比表面积可以负载更多的Ru(bpy)32+阳离子，进而增强传感器的发光强度来提高其灵敏度。且使用一种新型纳米多孔材料Au@NiFeMOFs作为猝灭剂并引入到电化学发光领域。其中Au纳米粒子和NiFeMOFs都可以猝灭Ru(bpy)32+/Zn-oxalateMOFs的发光效应，达到双重猝灭的效果。且Au@NiFeMOFs因为其多孔性具有较大的比表面积可以负载更多的Aβ。如上所述都可以大大增强传感器的灵敏度。在此夹心型免疫传感器中，随着Aβ浓度的增大，结合到电极传感界面的双重猝灭剂增多，对Ru(bpy)32+/Zn-oxalateMOFs发光效率的猝灭强度增大，导致化学发光信号减小。此外，本专利技术设计的双猝灭夹心型免疫传感器也为其它蛋白质毒素的检测提供了一种新方法。目前基于Ru(bpy)32+/Zn-oxalateMOFs构建双猝灭型免疫传感器来检测Aβ的方法还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种更简单可靠的基于Ru(bpy)32+/Zn-oxalateMOFs的电致化学发光免疫传感器的制备方法和应用，实现对蛋白质毒素Aβ的快速、灵敏、特异、高效检测。本专利技术的技术方案如下：为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：1.Ru(bpy)32+/Zn-oxalatedMOFs标记β-淀粉样蛋白第一抗体孵化物溶液、Au@NiFeMOFs标记β-淀粉样蛋白第二抗体孵化物溶液的制备（1）Ru(bpy)32+/Zn-oxalatedMOFs的制备将10mg~20mg三联吡啶氯化钌六水合物和80mg~120mg硝酸锌同时加入到45mLN,N-二甲基甲酰胺和超纯水1~3:1的混合液中，继续加入200μL~400μL、0.75molL-1草酸，2mL~4mL、3molL-1盐酸，室温超声5min，将混合物转移至圆底烧瓶中，60℃回流12h~36h，离心分离悬浮物，分别用N,N-二甲基甲酰胺和超纯水各洗涤三次得到橙红色沉淀，35℃真空干燥，得到Ru(bpy)32+/Zn-oxalatedMOFs复合物；（2）Ru(bpy)32+/Zn-oxalatedMOFs标记β-淀粉样蛋白第一抗体孵化物溶液的制备将10mmol~30mmolEDC和5mmol~15mmolNHS加入到1mL~3mL、1mgmL-1的Ru(bpy)32+/Zn-oxalatedMOFs溶液4℃震荡反应2h以活化Ru(bpy)32+/Zn-oxalatedMOFs表面的羧基基团，洗去未反应交联剂后加入400μL~600μL、1μgmL-1的β-淀粉样蛋白第一抗体溶液继续4℃震荡反应10h~14h使得第一抗体通过酰胺反应结合到Ru(bpy)32+/Zn-oxalatedMOFs的表面，离心分离Ru(bpy)32+/Zn-oxalatedMOFs标记β-淀粉样蛋白第一抗体孵化物，用pH7.5的PBS溶液洗去未反应的第一抗体后分散于pH=7.5的PBS缓冲溶液中，制得0.5mg/mL~5mg/mL的Ru(bpy)32+/Zn-oxalatedMOFs标记β-淀粉样蛋白第一抗体溶液，储存于4℃中备用；（3）Au@NiFeMOFs的制备将140mg~160mg六水合氯化镍和260mg~280mg二水合柠檬酸三钠分散于20mL超纯水中磁力搅拌5min，同样将130mg~150mg的铁氰化钾分散于20mL超纯水中磁力搅拌5min，然后将两种溶液混合继续在室温下搅拌8h~12h，离心分离悬浮物，使用超纯水和乙醇分别洗涤2次，35℃真空干燥，得到土黄色纳米多孔NiFeMOFs；将30mg~50mg纳米多孔NiFeMOFs分散在50mL超纯水中，加入1mL~3mL、1%~3%的氯金酸溶液，室温下搅拌5min，加入4mg~6mg聚乙烯吡咯烷酮抑制金纳米粒子的团聚，然后加入70mg~90mg还原剂柠檬酸三钠，0.5mg~1mg硼氢化钠室温下搅拌8h~12h，溶液慢慢变成紫黑色，离心分离悬浮物，超纯水洗涤至上清液无色，35℃真空干燥12h，得到紫黑色固体Au@NiFeMOFs；（4）Au@NiFeMOFs标记β-淀粉样蛋白第二抗体孵化物溶液的制备将6mg~10mg的Au@NiFeMOFs分散于1mLpH=7.5的PBS中，加入4μL~6μL、6mg/mL的第二抗体，4℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12h~24h，4℃离心分离洗去未结合第二抗体，然后加入1mL0.1%的牛血清白蛋白溶液4℃恒温振荡培养箱中振荡孵化2h~4h封闭Au@NiFeMOFs表面的非特异性活性位点，4℃离心分离洗去未结合牛血清白蛋白，最后分散于pH=7.5的PBS缓冲溶液中，制得0.5mg/mL~5mg/mL的Au@NiFeMOFs标记β-淀粉样蛋白第二抗体溶液，储存于4℃中备用。2.一种Ru(bpy)32+/Zn-oxalatedMOFs的双猝灭夹心型电致化学发光传感器的制备方法，包括以下步骤：（1）分别用1.0mm、0.3mm、0.05mm的氧化铝抛光粉对直径4mm的玻碳电极做抛光处理，用超纯水冲洗干净；（2）将6µL、0.5mg/mL~5mg/mLRu(bpy)32+/Zn-oxalatedMOFs标记β-淀粉样蛋白第一抗体溶液滴涂至电极表面，4℃晾干；（3）将2μL~4μL体积分数为0.5%的牛血清白蛋白溶液于电极表面，以封闭非特异性活性位点，用pH=7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4℃晾干；（4）将6μL、一定浓度的β-淀粉样蛋白溶液滴加到电极表面，用pH=7.5的P本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于Ru(bpy)32+/Zn‑oxalated MOFs的双猝灭夹心型电致化学发光免疫传感器的制备方法及应用，其特征在于，步骤如下：（1）Ru(bpy)32+/Zn‑oxalated MOFs的制备将10 mg ~ 20 mg三联吡啶氯化钌六水合物和80 mg ~ 120 mg硝酸锌同时加入到45 mL N, N‑二甲基甲酰胺和超纯水1 ~ 3:1的混合液中，继续加入200 μL ~ 400 μL、0.75 mol L‑1草酸，2 mL ~ 4 mL、3 mol L‑1盐酸，室温超声5 min，将混合物转移至圆底烧瓶中，60 ℃回流12 h ~ 36 h，离心分离悬浮物，分别用N, N‑二甲基甲酰胺和超纯水各洗涤三次得到橙红色沉淀，35 ℃真空干燥，得到Ru(bpy)32+/Zn‑oxalated MOFs复合物；（2）Ru(bpy)32+/Zn‑oxalated MOFs标记β‑淀粉样蛋白第一抗体孵化物溶液的制备将10 mmol ~ 30 mmol EDC和5 mmol ~ 15 mmol NHS加入到1 mL ~ 3 mL、1 mg mL‑1的Ru(bpy)32+/Zn‑oxalated MOFs溶液4 ℃震荡反应2 h以活化Ru(bpy)32+/Zn‑oxalated MOFs表面的羧基基团，洗去未反应交联剂后加入400 μL ~ 600 μL、1 μg mL‑1的β‑淀粉样蛋白第一抗体溶液继续4 ℃震荡反应10 h ~ 14 h使得第一抗体通过酰胺反应结合到Ru(bpy)32+/Zn‑oxalated MOFs的表面，离心分离Ru(bpy)32+/Zn‑oxalated MOFs标记β‑淀粉样蛋白第一抗体孵化物，用pH 7.5的PBS溶液洗去未反应的第一抗体后分散于pH = 7.5的PBS缓冲溶液中，制得0.5 mg/mL ~ 5 mg/mL的Ru(bpy)32+/Zn‑oxalated MOFs标记β‑淀粉样蛋白第一抗体溶液，储存于4 ℃中备用；（3）Au@NiFe MOFs的制备将140 mg ~ 160 mg六水合氯化镍和260 mg ~ 280 mg二水合柠檬酸三钠分散于20 mL超纯水中磁力搅拌5 min，同样将130 mg ~ 150 mg的铁氰化钾分散于20 mL超纯水中磁力搅拌5 min，然后将两种溶液混合继续在室温下搅拌8 h ~ 12 h，离心分离悬浮物，使用超纯水和乙醇分别洗涤2次，35 ℃真空干燥，得到土黄色纳米多孔NiFe MOFs；将30 mg ~ 50 mg纳米多孔NiFe MOFs分散在50 mL超纯水中，加入1 mL ~ 3 mL 1% ~ 3%的氯金酸溶液，室温下搅拌5 min，加入4 mg ~ 6 mg聚乙烯吡咯烷酮抑制金纳米粒子的团聚，然后加入70 mg ~ 90 mg还原剂柠檬酸三钠，0.5 mg ~ 1 mg硼氢化钠室温下搅拌8 h ~ 12 h，溶液慢慢变成紫黑色，离心分离悬浮物，超纯水洗涤至上清液无色，35 ℃真空干燥12 h，得到紫黑色固体Au@NiFe MOFs；（4）Au@NiFe MOFs标记β‑淀粉样蛋白第二抗体孵化物溶液的制备将6 mg ~ 10 mg的Au@NiFe MOFs分散于1 mL pH = 7.5的PBS中，加入4 μL ~ 6 μL、6 mg/mL的第二抗体，4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h ~ 24 h，4 ℃离心分离洗去未结合第二抗体，然后加入1 mL 0.1%的牛血清白蛋白溶液4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化2 h ~ 4 h封闭Au@NiFe MOFs表面的非特异性活性位点，4 ℃离心分离洗去未结合的牛血清白蛋白，最后分散于pH = 7.5的PBS缓冲溶液中，制得0.5 mg/mL ~ 5 mg/mL的Au@NiFe MOFs标记β‑淀粉样蛋白第二抗体溶液，储存于4 ℃中备用；（5）分别用1.0 mm、0.3 mm、0.05 mm的氧化铝抛光粉对直径4 mm的玻碳电极做抛光处理，用超纯水冲洗干净；（6）将6 µL、0.5 mg/mL ~ 5 mg/mL Ru(bpy)32+/Zn‑oxalated MOFs标记β‑淀粉样蛋白第一抗体溶液滴涂至电极表面，4 ℃晾干；（7）将2 μL ~ 4 μL体积分数为0.5%的牛血清白蛋白溶液于电极表面，以封闭非特异性活性位点，用pH = 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃晾干；（8）将6 μL、一定浓度的β‑淀粉样蛋白溶液滴加到电极表面，用pH = 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃晾干（9）将6 μL、0.5 mg/mL ~ 5 mg/mL的Au@NiFe MOFs标记β‑淀粉样蛋白第二抗体溶液滴加到电极表面，4 ℃晾干，用pH = 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，制得一种基于Ru(bpy...

【技术特征摘要】
1.一种基于Ru(bpy)32+/Zn-oxalatedMOFs的双猝灭夹心型电致化学发光免疫传感器的制备方法及应用，其特征在于，步骤如下：（1）Ru(bpy)32+/Zn-oxalatedMOFs的制备将10mg~20mg三联吡啶氯化钌六水合物和80mg~120mg硝酸锌同时加入到45mLN,N-二甲基甲酰胺和超纯水1~3:1的混合液中，继续加入200μL~400μL、0.75molL-1草酸，2mL~4mL、3molL-1盐酸，室温超声5min，将混合物转移至圆底烧瓶中，60℃回流12h~36h，离心分离悬浮物，分别用N,N-二甲基甲酰胺和超纯水各洗涤三次得到橙红色沉淀，35℃真空干燥，得到Ru(bpy)32+/Zn-oxalatedMOFs复合物；（2）Ru(bpy)32+/Zn-oxalatedMOFs标记β-淀粉样蛋白第一抗体孵化物溶液的制备将10mmol~30mmolEDC和5mmol~15mmolNHS加入到1mL~3mL、1mgmL-1的Ru(bpy)32+/Zn-oxalatedMOFs溶液4℃震荡反应2h以活化Ru(bpy)32+/Zn-oxalatedMOFs表面的羧基基团，洗去未反应交联剂后加入400μL~600μL、1μgmL-1的β-淀粉样蛋白第一抗体溶液继续4℃震荡反应10h~14h使得第一抗体通过酰胺反应结合到Ru(bpy)32+/Zn-oxalatedMOFs的表面，离心分离Ru(bpy)32+/Zn-oxalatedMOFs标记β-淀粉样蛋白第一抗体孵化物，用pH7.5的PBS溶液洗去未反应的第一抗体后分散于pH=7.5的PBS缓冲溶液中，制得0.5mg/mL~5mg/mL的Ru(bpy)32+/Zn-oxalatedMOFs标记β-淀粉样蛋白第一抗体溶液，储存于4℃中备用；（3）Au@NiFeMOFs的制备将140mg~160mg六水合氯化镍和260mg~280mg二水合柠檬酸三钠分散于20mL超纯水中磁力搅拌5min，同样将130mg~150mg的铁氰化钾分散于20mL超纯水中磁力搅拌5min，然后将两种溶液混合继续在室温下搅拌8h~12h，离心分离悬浮物，使用超纯水和乙醇分别洗涤2次，35℃真空干燥，得到土黄色纳米多孔NiFeMOFs；将30mg~50mg纳米多孔NiFeMOFs分散在50mL超纯水中，加入1mL~3mL1%~3%的氯金酸溶液，室温下搅拌5min，加入4mg~6mg聚乙烯吡咯烷酮抑制金纳米粒子的团聚，然后加入70mg~90mg还原剂柠檬酸三钠，0.5mg~1mg硼氢化钠室温下搅拌8h~12h，溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵冠辉，曹伟，王耀光，李小建，东雪，房靖龙，魏琴，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37